[發明專利]一種基于固相富集結合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法

在審

• 申請號: 202111487621.3
• 申請日: 2021-12-08
• 公開（公告）號: CN114354778A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 楊霜;李佳佳
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/12;G01N30/86
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

本發明公開了一種基于固相富集結合O?糖肽酶切分析Tn抗原的方法，包括步驟：蛋白提取和濃度測量；蛋白酶解；多肽純化；固相結合；唾液酸處理；N聚糖切除；OpeRATOR酶切；O?Glycoprotease酶切；LC?MS分析。該方法能夠在固相上耦合糖肽，使用兩種O?糖肽酶切O?糖肽來鑒定Tn抗原的O?糖基化位點和Tn抗原的表達量，用作癌癥診斷的生物標志物。

技術領域

本發明屬于生物分子分析試劑技術領域，具體涉及固相偶聯糖肽和采用O-糖肽酶切富集Tn抗原的分析方法。

背景技術

Tn抗原(O-GalNAc)是一種與腫瘤相關的碳水化合物，在大多數癌組織表面高表達。它的分子量小、結構簡單、通常表達在細胞表面，可被免疫系統識別為外來物。因此，檢測Tn抗原的表達不僅反映免疫抑制微環境的情況，并且可作為癌癥的診斷標志物-特別是早期階段的特征，也可顯示腫瘤的進展以及預后狀況。目前對于Tn抗原的檢測手段主要有單克隆抗體、凝集素富集以及點擊化學等。這些方法大多缺乏特異性和靈敏度，易造成結果的假陽性和假陰性率，且步驟繁瑣、成本高。點擊化學的催化效率低且重現性差。無銅點擊化學生物素方法，所用試劑較為昂貴且疊氮化物劇毒、易爆炸。目前缺乏一種高效便捷的方法能夠檢測Tn抗原的表達及鑒定其在標志物中的特異性位點。

因此，有必要研發一種基于固相富集結合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法來解決現有技術中鑒定Tn抗原糖蛋白標志物的問題。

發明內容

本發明目的是提供一種基于固相富集結合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法。

本發明的一種技術方案是：

一種基于固相富集結合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法，包括步驟：

1)蛋白提取和濃度測量；

2)蛋白酶解；

3)多肽純化；

4)固相結合；

5)唾液酸處理；

6)N聚糖切除；

7)OpeRATOR酶切；

8)O-Glycoprotease酶切；

9)LC-MS分析。

進一步的，在步驟1)中，所述蛋白提取和濃度測量包括：在細胞中依次加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和EDTA后，使用超聲破碎儀破碎，冷卻，重復操作直至樣本溶液澄清，離心，取上層清液并用1×Tris稀釋，使用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒測試蛋白的濃度。

進一步的，在步驟2)中，所述蛋白酶解包括步驟：

(1)根據測定的蛋白的濃度，從上層清液中取蛋白，使得所述蛋白的總量在400-600ug，溶于尿素，輕微振蕩，直至蛋白完全溶解，獲得樣品溶液；

(2)向所述樣品溶液中加入總體積1/10的TCEP，孵育；

(3)向所述樣品溶液中加入總體積1/10的IAA，置于暗箱中孵育；

(4)向所述樣品溶液中加入HPLC水，使得所述樣品溶液中尿素的濃度＜1.6M，調節所述樣品溶液的pH至7-9；

(5)向所述樣品溶液中加入胰蛋白酶，使得所述樣品溶液的蛋白量與所述胰蛋白酶的體積比為50:1～40:1，孵育過夜。

進一步的，在步驟3)中，所述多肽純化包括步驟：

(1)向所述樣品溶液中加入甲酸，使所述樣品溶液的pH＜3；

(2)將所述樣品溶液加入預先處理的C18萃取柱中，重復操作；