[發(fā)明專利]甘露糖6-磷酸脫磷酶突變體及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111486922.4
• 申請(qǐng)日: 2021-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN116240195A
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊建剛;田朝玉;張同;孫媛霞;馬延和
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N9/16
• 分類號(hào): C12N9/16;C12N15/55;C12P19/02;C12P19/24;C12P19/18;C12P19/16
• 代理公司: 北京知文通達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽(yáng)石文

本發(fā)明公開一種催化特異性和/或活性高的甘露糖6?磷酸脫磷酶突變體，其通過(guò)大量篩選獲得單位點(diǎn)突變的突變體，進(jìn)一步通過(guò)飽和突變獲得組合突變，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，相比野生型而言，突變體的催化活性最高可以提高近20倍，反應(yīng)體系中甘露糖提升至96%。因此，本發(fā)明具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物催化和生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及催化特異性和活性高的甘露糖6-磷酸脫磷酶突變體以及其合成甘露糖的應(yīng)用。

背景技術(shù)

D-甘露糖是一種低熱量的單糖，其甜度約是蔗糖的60％，其與D-葡萄糖互為2位差向異構(gòu)體，與果糖互為醛酮異構(gòu)體。研究表明，甘露糖具有多種生理功能，包括誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；促進(jìn)胰島素分泌，控制I型糖尿病；促進(jìn)腸道有益菌的增殖等。此外，甘露糖還在D-甘露醇、維生素、抗腫瘤藥的合成中充當(dāng)重要前體。

目前，D-甘露糖的制備主要依賴于從植物組織、微生物細(xì)胞壁中提取，或者以葡萄糖等為底物進(jìn)行化學(xué)異構(gòu)。前者存在著提取率低、能耗大的問(wèn)題，后者面臨著副產(chǎn)物多、后續(xù)純化操作復(fù)雜等限制。近年來(lái)，伴隨著越來(lái)越多酶(包括來(lái)蘇糖異構(gòu)酶、甘露糖異構(gòu)酶、纖維二糖2位差向異構(gòu)酶)的發(fā)現(xiàn)，學(xué)者開始研究用酶催化的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)甘露糖的綠色轉(zhuǎn)化，但是這些異構(gòu)反應(yīng)由于熱力學(xué)平衡限制導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低，不超過(guò)25％；另一方面，如果以蔗糖或者淀粉為底物，在磷酸化酶(GP/SP)的催化下生成G1P，然后磷酸葡萄糖變位酶(PGM)催化得到G6P，其再經(jīng)過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)、磷酸甘露糖糖異構(gòu)酶(PMI)反應(yīng)分別生成F6P和M6P，最后由甘露糖6-磷酸脫磷酶(M6PP)的作用將磷酸基團(tuán)水解即可獲得甘露糖。該路線由熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)，理論上可以實(shí)現(xiàn)100％轉(zhuǎn)化。專利WO2018169957A1公布了以淀粉、蔗糖等廉價(jià)原料合成甘露糖的方法，然而該專利文本中尚未明確說(shuō)明所用磷酸酶的酶活性和特異性數(shù)據(jù)，盡管表述了采用多酶體系合成甘露糖實(shí)施例，但是尚未給出體系具體的轉(zhuǎn)化率值，真實(shí)性缺乏可參考意義。專利CN201910126884.8也公布了以淀粉、蔗糖、葡萄糖等廉價(jià)原料實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化合成甘露糖，然而該專利中涉及到的甘露糖6-磷酸磷酸存在活性低，僅為1.8U/mg，且存在副產(chǎn)物葡萄糖和果糖。因此，提高M(jìn)6PP的催化特異性及催化效率對(duì)甘露糖的生物制備至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)，獲得催化特異性和/或活性高的甘露糖6-磷酸脫磷酶突變體。

本發(fā)明提供一種催化特異性和/或活性高的甘露糖6-磷酸脫磷酶突變體，其特征在于，其相對(duì)于SEQ?ID?NO.1存在下述氨基酸位點(diǎn)或其組合位點(diǎn)的突變：第18位，第43位，第47位，第48位，第51位，第63位，第64位，第125位。

優(yōu)選地，其相對(duì)于SEQ?ID?NO.1存在下述氨基酸位點(diǎn)或其組合位點(diǎn)的突變：第18位突變?yōu)镵、Q或S，第43位突變?yōu)镠、L或Y，第47位突變?yōu)長(zhǎng)、T或F，第48位突變?yōu)镮、L或V，第51位突變?yōu)镮、K或T，第63位突變?yōu)長(zhǎng)、T或H，第64位突變?yōu)門、Y或S，第125位突變?yōu)镈、F或G。