[發(fā)明專利]一種柴胡原生質(zhì)體的制備及瞬時轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111486799.6
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN113980885A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余馬;馮亮;陳華;趙軍;羅勇;李玉嬋;莫傳鑫;董凱密;劉曉艷;謝文霖
• 申請（專利權(quán)）人: 西南科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;C12N15/55;A01H4/00
• 代理公司: 成都知棋知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51325
• 代理人: 馬超前

本發(fā)明公開了一種柴胡原生質(zhì)體的制備及瞬時轉(zhuǎn)化方法，該方法包含：原生質(zhì)體制備和原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化；所述原生質(zhì)體制備，包含：將柴胡下胚軸愈傷組織經(jīng)酶解液在避光條件下酶解處理，并進(jìn)行純化，得到柴胡原生質(zhì)體；所述原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化，包含：將所述柴胡原生質(zhì)體和Crispr/Cas9?T3T4質(zhì)粒混合，加入聚乙二醇轉(zhuǎn)化液，室溫孵育，待孵育結(jié)束后加入W5溶液終止反應(yīng)，離心收集經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)化的柴胡原生質(zhì)體，并重懸于MMG溶液中，室溫避光孵育。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)柴胡下胚軸愈傷原生質(zhì)體的制備，采用本發(fā)明的方法制備的原生質(zhì)體完整好，濃度可達(dá)10⁶個/mL，可有效保證瞬時轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)培養(yǎng)的濃度要求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種柴胡原生質(zhì)體的制備及瞬時轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

柴胡(Radix Bupleuri)是一種中藥材，《中國藥典》規(guī)定正品柴胡為北柴胡及狹葉柴胡的干燥根。近年來對北柴胡的研究主要集中在采用傳統(tǒng)育種方法培育柴胡新品種，這些方式耗時長，效率低。目前結(jié)合基因組學(xué)、分子生物學(xué)的基因編輯技術(shù)已成為新品種選育的有力工具。但是，由于柴胡轉(zhuǎn)化體系技術(shù)還不成熟，制約了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究柴胡基因功能，而利用原生質(zhì)體可以對植物基因功能進(jìn)行快速驗證，因而，對柴胡原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化研究具有重要意義，但目前尚未有對柴胡建立外源基因轉(zhuǎn)化體系的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種柴胡原生質(zhì)體的制備及瞬時轉(zhuǎn)化方法，解決了目前柴胡轉(zhuǎn)化體系技術(shù)還不成熟的問題，該方法制備的原生質(zhì)體完整好，濃度可達(dá)10⁶個/mL，可有效保證瞬時轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)培養(yǎng)的濃度要求。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種柴胡原生質(zhì)體的制備及瞬時轉(zhuǎn)化方法，該方法包含：原生質(zhì)體制備和原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化；所述原生質(zhì)體制備，包含：將柴胡下胚軸愈傷組織經(jīng)酶解液在避光條件下酶解處理，并進(jìn)行純化，得到柴胡原生質(zhì)體；所述原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化，包含：將所述柴胡原生質(zhì)體和Crispr/Cas9-T3T4質(zhì)粒混合，加入聚乙二醇轉(zhuǎn)化液，室溫孵育，待孵育結(jié)束后加入W5溶液終止反應(yīng)，離心收集經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)化的柴胡原生質(zhì)體，并重懸于MMG溶液中，室溫避光孵育，并通過基因編輯靶位點分析驗證原生質(zhì)體是否轉(zhuǎn)化成功；其中，其中，所述Crispr/Cas9-T3T4質(zhì)粒為pHEE401E-T3T4質(zhì)粒，其構(gòu)建為：以pCBC-DT1T2質(zhì)粒為模板，采用核苷酸序列為SEQ ID NO.6～9的引物，進(jìn)行Overlapping PCR構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒，將產(chǎn)物連接至pHEE401E質(zhì)粒，從而構(gòu)建pHEE401E-T3T4質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述柴胡下胚軸愈傷組織的制備，包含：將柴胡種子用無菌水浸泡，去除漂浮的種子，將種子轉(zhuǎn)移用加2％PPM的無菌水在4℃暗光振蕩消毒；將消毒后的種子轉(zhuǎn)移至種子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該種子萌發(fā)培養(yǎng)基包含：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、30g蔗糖、4g植物凝膠、0.1％PPM；取發(fā)芽的柴胡幼苗，切取柴胡下胚軸并置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、30g蔗糖、4g植物凝膠、0.5％PPM、3mg/L 6-BA、2.2mg/L 2,4-D、0.8mg/LKT。

優(yōu)選地，所述發(fā)芽的柴胡幼苗為發(fā)芽14～16天的柴胡幼苗。

優(yōu)選地，所述消毒時間為12h。

優(yōu)選地，所述酶解液包含：2％Cellulase R-10、1％Macerozyme R-10、0.4M甘露醇、20mM pH＝5.7的MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％BSA和ddH₂O。

優(yōu)選地，所述酶解液包含：2％Cellulase R-10、1％Macerozyme R-10、0.4M甘露醇、20mM pH＝5.7的MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％BSA和ddH₂O。