[發明專利]一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜鑒定方法及構建方法

在審

• 申請號: 202111486742.6
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114292938A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 劉紹雄;孫達鋒;華蓉;李雪松;張俊波;羅孝坤;馬明;尚陸娥
• 申請（專利權）人: 中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/686;G16B30/00
• 代理公司: 北京盛凡佳華專利代理事務所(普通合伙) 11947
• 代理人: 金福坤

1.一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR標記指紋圖譜的鑒定方法，其特征在于，6對SSR標記，由DQGGSSR007、DQGGSSR031、DQGGSSR034、DQGGSSR037、DQGGSSR065、DQGGSSR088構成，具體序列如下：

相應帶型編號組合為：2/(3+5)/1/1/1/1。

2.根據權利要求1所述的一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜的構建方法，包括以下步驟：

S1、菌絲培養：將金黃色大球蓋菇菌株轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基(PDA)上，25℃培養15d后收集菌絲；

S2、基因組DNA的提取：使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒(TSP101-200)提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和質量；

S3、SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行SSR標記的PCR擴增；

S4、電泳檢測：將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到毛細管電泳所需濃度；

S5、毛線管電泳檢測；

S6、GeneMapper數據分析。

3.根據權利要求2所述的一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述S2中的試劑盒法提取菌絲的基因組DNA具體方法包括：

S1、將Spin Colu2置于Collection Tube中，加入250μl Buffer BL，12000rpm/min離心1min活化硅膠膜；

S2、取菌絲樣本，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml離心管中，加入400μl BuffergP1，渦旋振蕩1min，65℃水浴10～30min，期間可取出顛倒混勻以充分裂解；

S3、加入150μl Buffer gP2，渦旋振蕩1min，冰浴5min；

S4、12000rpm/min離心5min，將上清轉移至新的離心管中；

S5、加入上清等體積的無水乙醇，立即充分振蕩混勻，液體全部轉入Spin Colu2中，12,000rpm/min離心30s，棄廢液；

S6、向Spin Colu2中加入500μl Buffer Pw(使用前已加入無水乙醇)，12000rpm/min離心30s，棄廢液；

S7、向Spin Colu2中加入500μl WasN006#Buffer(使用前已加入無水乙醇)，12000rpm/min離心30s，棄廢液；

S8、重復操作步驟S7；

S9、將Spin Colu2放回Collection Tube中，12,000rpm/min離心2min，開蓋晾干1min；

S10、取出Spin Colu2，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中央處加50～100μl TEBuffer(65℃預熱TE Buffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm/min離心2min；

S11、取2ul的DNA原液用于1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，取2ul的DNA原液用于NanoDrop分光光度計檢測濃度和質量，剩余DNA保存于-20℃。

4.根據權利要求2所述的一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述S3中的PCR擴增體系為：總體積20ul，包括：擎科TSE101-金牌Mix(green)16.45ul，10μM Tag DNA酶1.2ul，10umol/L SSR標記正向引物和反向引物各1.2uL，模板DNA1uL。

5.根據權利要求2所述的一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述PCR反應條件：98℃2min；98℃10second，60℃10second，72℃10second，35個循環；72℃5min。

6.根據權利要求2所述的一種金黃色大球蓋菇菌株的SSR指紋圖譜的構建方法，其特征在于：所述S4中電泳的加樣量為2ul樣品和6ul溴酚藍，電壓為300V，時間12分鐘。