[發明專利]桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用

在審

• 申請號: 202111485748.1
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114106584A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 張振粉;張玉娟;柳小妮;李向陽;張宏;趙亮;姚博;黃榮;賈倩英
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C09B61/00
• 分類號: C09B61/00;C09B67/54;C12Q1/18;C12R1/645
• 代理公司: 合肥律通專利代理事務所(普通合伙) 34140
• 代理人: 張曉芹

1.桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：包括如下步驟：

1)供試菌株的選取，包括:

分離自紫花苜蓿種子的桃色歐文氏菌(Cp₂)和番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、馬鈴薯絲核病菌、黃瓜枯萎病菌及苜蓿根腐病菌5種真菌；

2)供試培養基的選擇,包括：

營養瓊脂培養基(NA)：牛肉膏，3g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；水，1000mL；瓊脂，15-20g，以用于Cp₂菌株的培養和短期保存；

King’s B培養基：蛋白胨，20g；K₂HPO₄，1.15g；MgSO₄·7H₂O，1.5g；甘油，10mL；水，1000mL；瓊脂，15-20g，用于Cp₂粉色素的培養與富集；

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)：土豆，200g；葡萄糖，20g；瓊脂，15-20g；以用于病原真菌的培養及對照；

粉色素PDA培養基(PPPDA)：在PDA培養基的基礎上加入體積比為20％的粉色素(OD₃₄₀＝0.785)提取液,以用于5種病原真菌的抑菌活性研究；

3)桃色歐文氏菌粉色素的制備；

4)粉色素的提取純化；

5)粉色素的波長掃描；

6)粉色素穩定性測試；

7)粉色素對病原真菌的抑制性測試。

2.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：步驟2)中，所述營養瓊脂培養基和King’s B培養基PH值選擇7.0-7.2，同時在121℃滅菌20min，所述PDA培養基的PH值為自然狀態下PH，同時在121℃下滅菌20min。

3.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用：步驟3)中，所述桃色歐文氏菌粉色素的制備選用接種環刮取NA培養平板的菌體，單線法接種于King’s B培養基，28℃黑暗條件下培養72h左右，至菌體內包含大量色素時用藥匙刮取，備用。

4.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：步驟4)中，所述粉色素的提純方法包括粉色素的粗提取和純化，分別用有機溶劑浸提法和萃取法，收集培養平板內的菌體，用藥匙刮取1.0g置于10mL離心管中，分別加入5mL蒸餾水、氯仿、乙酸乙酯、異戊醇、石油醚、冰醋酸、正丁醇和無水乙醇中浸泡2h，同時此過程中每隔30min用渦旋振蕩器震蕩1min，再用12000rpm的離心機離心15min后收集上清液，觀察粉色素在各溶劑中的溶解狀況，選擇最佳浸提溶液和萃取溶液，從而得到純色素提取液。

5.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：步驟5)中，所述粉色素的掃描用紫外分光廣度計光譜掃描模式掃描純色素溶液在間隔為1nm時200-800nm的波長，以確定粉色素的特征波長。

6.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：步驟6)中，所述粉色素的性能測試包括：光穩定性測試、溫度穩定性測試、PH穩定性測試、金屬離子穩定性測試、氧化還原穩定性測試。

7.根據權利要求1所述的桃色歐文氏菌粉色素的提純工藝及其應用，其特征在于：步驟7)中，所述粉色素對病原真菌的抑制性能研究方法為用直徑為5mm的打孔器在培養的菌落邊緣同一圓周上打取菌餅，接入PDA(對照)和PPPDA培養基中央，每組處理三次重復，置于25℃恒溫箱中黑暗培養。以對照組菌落邊緣接近皿壁時為時間結點，期間連續每天用十字交叉法測量各處理的菌落直徑(即為生長速率)，并計算生長抑制率；

生長抑制率(％)＝(對照菌落的直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落的直徑-菌餅直徑)×100％。