[發明專利]一種利用DNA改組提高大腸桿菌工程菌產核黃素能力的方法

在審

• 申請號: 202111482246.3
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114181963A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 鄧永東;姚泉洪;田永生;張文慧;彭日荷;許晶;王波;高建杰;韓紅娟;王麗娟;王宇
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/31;C12P25/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 靳魁

本發明提供了一種利用DNA改組提高大腸桿菌工程菌產核黃素能力的方法，涉及基因工程領域，包括如下步驟：構建含26個基因的產核黃素的大腸桿菌工程菌；T7RNA聚合酶基因表達單元DNA重排和定向篩選，抽提獲得第一批陽性質粒；核黃素生物合成和轉運系統的DNA重排和定向篩選，抽提獲得第二批陽性質粒；大腸桿菌σ因子基因的DNA重排和定向篩選，抽提獲得第三批陽性質粒；將第三批質粒導入到不同底盤細胞獲得重組菌株；選取核黃素產量最高的陽性菌株。有效消除產核黃素的大腸桿菌工程菌構建過程中T7RNAP對大腸桿菌宿主的毒性問題、產物的反饋抑制問題以及構建的核黃素生物合成基因的適度和協調表達問題。進一步提高大腸桿菌工程菌株生物合成核黃素的效率和產量。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種利用DNA改組提高大腸桿菌工程菌產核黃素能力的方法。

背景技術

在構建合成核黃素的大腸桿菌工程菌的構建的基礎上，遇到了兩個存在的問題：

第一方面：T7 RNAP對大腸桿菌宿主的毒性問題。T7啟動子是最強的原核啟動子之一，高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍；同時由于T7啟動子沒法被大腸桿菌RNA聚合酶識別，只能被噬菌體自身編碼的T7 RNAP特異識別和調控；加上T7啟動子和終止子的長度均很短。鑒于以上特點和優勢，使T7表達系統成為外源基因高表達和原核合成生物學體系構建的首選。但T7 RNAP對大腸桿菌具有較強毒性，這使該體系的應用過程中面臨諸多困難。

第二方面：產物的反饋抑制、核黃素生物合成基因的適度和協調表達問題。創制復雜的合成生物學體系過程中，解除產物積累的反饋抑制非常重要，另外外源基因的高表達往往不利于最終產物的生物合成，而且每個基因表達不能在同一水平，而是存在某種合適的比例。

為進一步提高大腸桿菌工程菌株生物合成核黃素的效率和產量，本發明通過DNA重排和定向篩選體系上進一步優化，提高建庫容量和篩選效率，同時開展工程菌株的基因組DNA重排和定向篩選，以消除T7 RNAP對大腸桿菌宿主的毒性問題、產物的反饋抑制問題以及構建核黃素生物合成基因的適度和協調表達問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用DNA改組提高大腸桿菌工程菌產核黃素能力的方法，解決背景提出所提出的至少一個技術問題。

一種利用DNA改組提高大腸桿菌工程菌產核黃素能力的方法，所述方法包括：

構建含26個基因的產核黃素的大腸桿菌工程菌；

T7 RNA聚合酶基因表達單元DNA重排和定向篩選，獲得第一批陽性菌株，并抽提獲得第一批陽性質粒；

核黃素生物合成和轉運系統的DNA重排和定向篩選，獲得第二批陽性菌株，并抽提獲得第二批陽性質粒；

大腸桿菌σ因子基因的DNA重排和定向篩選，獲得第三批陽性菌株，并抽提獲得第三批陽性質粒；

將第三批質粒導入到不同底盤細胞獲得重組菌株；對重組菌株進行試管液體培養，并對每種工程菌株的核黃素生物合成產量進行分析測定，選取產量最高的陽性菌株。

優選的，所述T7 RNA聚合酶基因表達單元DNA重排和定向篩選的方法包括：

化學合成帶lacI阻遏蛋白的lac啟動子和T1終止子控制的T7RNAP基因表達單元；

根據轉化子菌落黃色深淺進行初步篩選；

挑取深黃色的大腸桿菌陽性菌落進行液體培養，并用HPLC技術準確測定培養液中的核黃素含量；

通過重排、建庫和定向篩選獲得第一批陽性菌株，并抽提獲得第一批陽性質粒。

優選的，所述核黃素生物合成和轉運系統的DNA重排和定向篩選的方法包括：