[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)多殺菌素J/L的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111481451.8
• 申請(qǐng)日: 2021-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN113999868A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃科學(xué);何天景;翟曉云;劉家亨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12N15/31;C12N1/21;C12N15/70;C12P19/62;C12N9/22;C12N15/113;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)多殺菌素J/L的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明中是以刺糖多孢菌QL?1為出發(fā)菌株，通過插入crRNA抑制刺糖多孢菌QL?1的spnK基因表達(dá)至失活，構(gòu)建得到高產(chǎn)多殺菌素J/L的QL?1/pQL?spnK?crRNA基因工程菌。本發(fā)明首次在刺糖多孢菌中引入CRISPRi技術(shù)，通過CRISPR/ddcpf1方法對(duì)spnK基因進(jìn)行了抑制失活，從而實(shí)現(xiàn)了多殺菌素J/L的高水平表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到了高產(chǎn)多殺菌素J/L的目的。本發(fā)明構(gòu)建的QL?1/pQL?spnK?crRNA工程菌可以穩(wěn)定傳代，并且能夠顯著提高刺糖多孢菌多殺菌素J/L的產(chǎn)量，是野生刺糖多孢菌的8～9倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)多殺菌素J/L的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

多殺菌素是從刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵液中提取得到的一種大環(huán)內(nèi)酯類生物殺蟲劑，具有無公害、高效、低毒、易降解等特點(diǎn)。它對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物無害，對(duì)哺乳動(dòng)物也無致癌作用。多殺菌素是一種混合物，在該混合物中，多殺菌素A和D是主要組分并且對(duì)關(guān)鍵昆蟲目標(biāo)具有最高活性。多殺菌素J和L(多殺菌素混合物中的兩種次要組分)是乙基多殺菌素(第二代多殺菌素殺蟲劑)的前體。乙基多殺菌素是5,6-二氫-3’-乙氧基多殺菌素J(主要組分)和3’-乙氧基多殺菌素L的混合物(參見說明書附圖圖1)，其是從多殺菌素J/L進(jìn)行乙基化和氫化兩步化學(xué)合成得到的，因此，能夠高產(chǎn)多殺菌素J/L的發(fā)酵菌株是工業(yè)化生產(chǎn)乙基多殺菌素的關(guān)鍵。從多殺菌素生物合成途徑分析，將spnK基因失活后，代謝流會(huì)發(fā)生改變，多殺菌素的發(fā)酵菌株將積累更多的多殺菌素J/L，而不是多殺菌素A/D，從而就可以得到大量的合成乙基多殺菌素的前體。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103119152A公開了修飾spnK基因以消除其表達(dá)的3’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，利用基因工程同源重組或是通過誘變或利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)對(duì)spnK基因進(jìn)行修飾使其失活，從而得到多殺菌素J/L的生產(chǎn)菌株。然而，這幾種方法均存在各種缺陷：通過同源重組使spnK失活，需要兩步篩選，效率非常低；通過誘變篩選得到spnK的基因突變株，需要更大規(guī)模的篩選，而且專一性差；RNAi無法完全抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，并且容易脫靶導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

CRISPR/Cas是新一代的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，能對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行精準(zhǔn)操作，實(shí)現(xiàn)基因片段的特異性插入，刪除，替換等，利用CRISPR/Cas技術(shù)可以改變基因的序列和功能，控制細(xì)胞的命運(yùn)和生命特征，為遺傳性疾病的治療提供新的方法。CRISPR/Cas系統(tǒng)存在于幾乎所有的古菌和大多數(shù)細(xì)菌中。CRISPR/Cas由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效應(yīng)蛋白如Cas9、Cpf1等)的編碼基因和一段CRISPR序列組成，后者由一段前導(dǎo)序列、許多重復(fù)序列和間隔序列順序排列組成。根據(jù)Cas基因的組成和效應(yīng)蛋白的數(shù)量，CRISPR被分為了2類5型，共16種亞型。1類為利用多個(gè)效應(yīng)蛋白復(fù)合物干擾靶基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2類為利用單一的效應(yīng)蛋白干擾靶基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究得最為清楚的CRISPR/Cas9為2類Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，2015年張鋒小組新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpf1屬于2類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)。其中Ⅱ類系統(tǒng)是目前使用最多且最簡(jiǎn)單的RNA指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶技術(shù)，該系統(tǒng)主要包含兩個(gè)成分：sgRNA和Cas9，其中sgRNA(single-guide RNA)是由細(xì)菌的內(nèi)源性CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA)融合而成的人工合成RNA，主要發(fā)揮引導(dǎo)作用；Cas9由HNH和RuvC兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域組成，可完成對(duì)外源DNA序列的識(shí)別和切割。