[發明專利]一種高活性和高熱穩定性的納豆激酶突變體有效

申請號：	202111478383.X	申請日：	2021-12-06
公開（公告）號：	CN114317502B	公開（公告）日：	2023-08-25
發明（設計）人：	周哲敏;羅杰;韓來闖;崔文璟;程中一;劉中美;周麗;郭軍玲	申請（專利權）人：	江南大學
主分類號：	C12N9/56	分類號：	C12N9/56;C12N15/57;C12N1/21;A23L29/00;A23L33/10;A61K38/48;A61P9/00;C12R1/125
代理公司：	哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211	代理人：	林娟
地址：	214122 江蘇***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種活性高熱穩定性激酶突變體
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【說明書】：

本發明公開了一種高活性和高熱穩定性的納豆激酶突變體，屬于蛋白質工程領域。本發明篩選得到三種納豆激酶突變體，分別是突變體M2(S62AN181DY217KN218SN259P)，突變體M3(P57CA92C)以及突變體M4(S62AP57CA92CN181DY217KN218SN259P)。其中突變體M4在55℃與65℃下半衰期分別較野生型提升了20.7倍與12.9倍，這是目前已有的報道中關于納豆激酶熱穩定性最優的突變體，同時比酶活也較野生型提升了2.1倍。本發明實現了在提升納豆激酶熱穩定性的同時保持其催化活性，以突破“穩定性活性的權衡”，為納豆激酶工業化應用奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種高活性和高熱穩定性的納豆激酶突變體，屬于蛋白質工程領域。

背景技術

納豆激酶(Natto?Kinase，NK)是枯草桿菌蛋白酶家族的一種依賴鈣離子的絲氨酸蛋白酶，作為一種高效的纖溶酶在血栓治療和食品工業中具有潛在的應用前景。然而，納豆激酶和其他嗜中性枯草桿菌絲氨酸蛋白酶一樣，在30℃-50℃具有廣泛的活性，但在55℃以上由于不可逆的自溶而迅速失活，這給工業領域的純化和催化帶來了困難。因此，熱穩定性更高的納豆激酶的開發將增加生物催化劑在醫藥和食品工業生產中的應用。針對這一問題，許多研究者通過在納豆激酶氨基酸序列中突變相應的氨基酸以引入氫鍵，二硫鍵，離子鍵等相互作用，以提升納豆激酶的熱穩定性。但是，在前期的針對納豆激酶的改造的研究中都會存在這樣一個問題：即提升熱穩定性的同時納豆激酶對應的催化效率就會降低，反之，提升催化效率的同時對應的熱穩定性就會降低，這一“穩定性-活性的權衡”使得納豆激酶的改造面臨較大的困難。

發明內容

為了解決上述問題，本發明通過對氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1的納豆激酶進行定點突變，以篩選獲得一系列納豆激酶突變體。

本發明的第一個目的是提供一種兼具高活性與高熱穩定性的納豆激酶突變體，所述納豆激酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2～SEQ?ID?NO.4所示。

本發明的第二個目的是提供一種編碼上述納豆激酶突變體的基因。

本發明的第三個目的是提供一種攜帶上述基因的重組載體。

本發明的第四個目的是提供一種攜帶上述基因，或上述重組載體的微生物細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物細胞以細菌或真菌為表達宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物細胞以枯草芽孢桿菌或大腸桿菌為表達宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物細胞以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis?ComK為宿主。

本發明的第五個目的是提供一種重組菌，所述重組菌表達上述納豆激酶突變體，以穿梭質粒pBP43-WapA-pro-NK-ter為表達載體，以枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilisComK為宿主。

本發明還提供上述納豆激酶突變體，或上述基因，或上述重組載體，或上述微生物細胞，或上述重組菌在醫藥、食品領域的應用。

本發明還提供上述納豆激酶突變體，或上述基因，或上述重組載體，或上述微生物細胞，或上述重組菌在制備治療、預防和/或緩解心血管疾病的藥物中的應用。