[發明專利]利用丙酮酸合成β-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 202111477590.3
• 申請日: 2021-12-06
• 公開（公告）號: CN113943691B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 馬紅武;毛雨豐;魏凡;李金龍;羅家豪;劉岯;袁倩倩
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了一種丙酮酸合成β?丙氨酸的新途徑，所述方法包括在酶催化下L?丙氨酸生成β?丙氨酸的反應，所述的酶選自脫氫酶和氨基變位酶。本發明的途徑步驟短、無碳損、無CO₂釋放再固定、無轉氨反應參與，并且發現四種不同物種來源的氨基變位酶可以催化關鍵反應L?丙氨酸生成β?丙氨酸。本發明解決了現有β?丙氨酸合成途徑碳損大、途徑復雜、能耗高等諸多問題，并且制備方法可在全細胞催化、補料發酵、連續發酵等可控制底物水平的生產過程中會發揮更為明顯的優勢，為綠色、高效、經濟的β?丙氨酸生物制造過程奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種利用丙酮酸合成β-丙氨酸的方法。

背景技術

β-丙氨酸（β-alanine）是天然存在的唯一β型氨基酸，是維生素B5、胍基丙酸、巴柳氮和肌肽等藥物的合成原料，也可以作為食品添加劑用于改善食物風味，在醫藥、化工、食品等領域具有廣泛應用。目前，β-丙氨酸的主要生產方法為化學合成法，包括丙稀晴法、丙烯酸法、亞氨基二丙烯法等，反應過程依賴高溫高壓等極端環境，部分工藝使用含腈原料，對環境和生物具有潛在危害。

近年來，生物法合成β-丙氨酸因其工藝簡單、條件溫和且對環境友好等優勢受到廣泛關注。生物法通過丙酮酸合成β-丙氨酸主要通過下述幾條途徑（1）三羧酸循環（TCA）還原臂生成富馬酸，富馬酸加氨生成天冬氨酸，通過天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸（Qian Y,Liu J, Song W, Chen X, Luo Q, Liu L. Production of β-alanine from fumaricacid using a dual-enzyme cascade. ChemCatChem, 2018, 10(21): 4984-4991）；此合成途徑基于天冬氨酸脫羧反應，原子經濟性差，β-丙氨酸理論碳得率低。（2）乙醛酸循環和三羧酸循環（TCA）氧化臂途徑導向β-丙氨酸的合成途徑（Song CW, Lee J, Ko Y-S, LeeSY. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 3-aminopropionic acid. Metabolic Engineering, 2015, 30: 121-129）；由于途徑中多步反應需要釋放CO₂，β-丙氨酸實際生產得率僅為0.14 C-mol/C-mol葡萄糖，遠低于理論得率1.00 C-mol/C-mol葡萄糖。（3）草酰乙酸轉氨、天冬氨酸脫羧合成β-丙氨酸途徑（Piao X,Wang L, Lin B, Chen H, Liu W, Tao Y. Metabolic engineering of Escherichiacoli for production of L-aspartate and its derivative β-alanine with highstoichiometric yield. Metabolic Engineering, 2019, 54: 244-254.）；該途徑中由L-天冬氨酸脫羧酶（ADC）脫去的CO₂可以通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCx）重新固定，理論得率可以達到1.00 C-mol/Cmol。但若要達到理論值，PEPCx必須將ADC脫去的CO₂進行100%再固定。而在實際過程中，即使結合一系列工藝優化，如采取好氧富集菌體-厭氧高密度發酵的兩階段發酵方式，在密閉的厭氧發酵罐中周期性補給 NH₄HCO₃，β-丙氨酸的厭氧階段實際得率仍然只有0.76 C-mol/C-mol葡萄糖。除了CO₂再固定的效率問題，該途徑還受到轉氨過程（由AspC催化）循環代謝物再生效率的制約，每分子草酰乙酸生成一分子天冬氨酸，需消耗一分子L-谷氨酸。（4）草酰乙酸直接加氨生成天冬氨酸，由天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸（Zou X, Guo L, Huang L, Li M, Zhang S, Yang A, Zhang Y, Zhu L, Zhang H,Zhang J, Feng Z.Pathway construction and metabolic engineering forfermentative production of β-alanine in Escherichia coli. AppliedMicrobiology and Biotechnology, 2020, 104(6): 2545-2559）；該途徑避免了L-谷氨酸再生效率約束，但仍未解決CO₂再固定效率問題，且實際得率僅為0.42 C-mol/C-mol。