[發明專利]一種腺病毒質粒載體及腺病毒的制備方法

在審

• 申請號: 202111471784.2
• 申請日: 2021-12-02
• 公開（公告）號: CN114085871A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 畢楊;范家銘;何通川
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬兒童醫院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N7/00
• 代理公司: 重慶立川知識產權代理事務所(普通合伙) 50285
• 代理人: 廖明亮

1.一種腺病毒質粒載體，包含5型腺病毒骨架基因序列，兩個反向末端重復序列，啟動子序列，多聚A尾序列，其特征在于：所述腺病毒質粒載體的啟動子序列和多聚A尾序列之間有如SEQ NO.1所示的位點序列1及如SEQ NO.2所示的位點序列2，位點序列1及位點序列2中由一個唯一的平末端限制性核酸內切酶識別位點序列連接。

2.如權利要求1所述的腺病毒質粒載體，其特征還在于：所述位點序列1及位點序列2之間由一個SwaI限制性內切酶識別序列連接，連接后的序列如SEQ No.3所示。

3.如權利要求1所述的腺病毒質粒載體，其特征還在于：包含綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列位于另一啟動子序列下游，用于編碼綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白。

4.如權利要求1或2所述的腺病毒質粒載體，其特征還在于：所述位點序列1與位點序列2之間有細菌自殺基因序列。

5.如權利要求4所述的腺病毒質粒載體，其特征還在于：所述細菌自殺基因序列為SEQNO.4所示ccdB表達盒，表達盒兩端有SwaI酶切位點，所述的腺病毒質粒載體序列為SEQNO.5。

6.如權利要求5所述的腺病毒質粒載體，其特征在于：所述腺病毒質粒載體包含綠色熒光蛋白開放閱讀框序列，序列為SEQ NO.6。

7.如權利要求5所述的腺病毒質粒載體，其特征在于：所述腺病毒質粒載體包含紅色熒光蛋白開放閱讀框序列，序列為SEQ NO.7。

8.一種一步法構建腺病毒的方法，包含以下步驟：

步驟1：設計5’端包含SEQ NO.1的上游引物及5’端包含SEQ NO.2的下游引物，PCR擴增獲得目的基因；

步驟2：用限制性內切酶酶切位點序列1及位點序列2之間的識別位點序列，獲得線性化載體片段；

步驟2：純化后的目的基因片段與線性化載體片段混合，通過Gibson DNA組裝，獲得帶有目的基因的重組腺病毒質粒；

步驟3：將帶有目的基因的重組腺病毒質粒經PacI酶切線性化，轉染到HEK-293或293A或293T腺病毒包裝細胞中，5-7天收集細胞，裂解細胞獲得腺病毒初提液；

步驟3：腺病毒初提液感染HEK-293或293A或293T細胞，進一步擴增，獲得高滴度病毒液。

9.一種腺病毒試劑盒，其特征在于：包含權利要求1-3或5-7所述腺病毒質粒載體。