[發明專利]一種帶香味基因水稻的育種方法

有效

• 申請號: 202111467314.9
• 申請日: 2021-12-03
• 公開（公告）號: CN114027176B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 喬保建;王思哲;夏祥華;朱迎婷;任代勝;葛偉強;楊家來;趙艷飛;曹秀敏;陶興武
• 申請（專利權）人: 安徽袁糧水稻產業有限公司
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;C12Q1/686;C12Q1/6895
• 代理公司: 蕪湖思誠知識產權代理有限公司 34138
• 代理人: 宦曉軍

1.一種帶香味基因水稻的育種方法，其特征在于，步驟如下：

（A）將含香味基因的恢復系川香29R作為供體F0，將含抗旱基因的無香不育系徽旱S作為受體F0，雜交后獲得F1代；

（B）F1代種植后采用KOH法鑒定篩選含香味基因的個體，將含香味基因的個體作為母本回交供體F0獲得F2；

（C）常規種植F2代，鑒定篩選F2代中含香味基因的個體，鑒定篩選步驟為：取F2代葉片采用CTAB法抽提基因組DNA，利用如下引物進行PCR反應：

上游：TGTTGTGGCATGTCCATGCTGCAAGC；

下游：GAATGATGCTCAAAGTGTCT；

使用實驗室常規PCR擴增技術，40μL反應體系包括基因組模板DNA?2μL、上游引物10μmol/μL?1μL、下游引物10μmol/μL?1μL、2×Mixture?4μL、滅菌雙蒸水32μL；在PCR儀上擴增，反應條件為：（1）94℃，預變性5min；（2）94℃?30s，55℃?40s，72℃?45s，共35個循環；（3）72℃延伸10min；反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測472bp附近是否有條帶，篩選有條帶的個體作為母本繼續回交供體F0，如此重復回交2代后獲得Fn代；

（D）將Fn代種植后于分蘗期取葉片，采用CTAB法抽提基因組DNA，采用SSR標記微衛星引物進行基因鑒定獲得香味純合基因型單株，其中SSR標記微衛星引物標記位點為：8號染色體上的RM5911和RM7191；

反應混合液體積為25μL，其中微衛星引物0.2μM，TaqDNA聚合酶1.5?U，基因組模板DNA50-100?ng，dNTP各200μM，2.5μL?10×PCR?Buffer：100?mMTris.Cl?pH?9.0；500?mMKC1；18?mM?MgCl2；1%?Triton?X-100；

PCR的反應參數為：(1)?94℃?5?min；(2)?94℃?50?sec，48℃?50?sec，72℃?2?min，共40個循環；(3)?72℃?5?min；

PCR擴增產物加入0.1倍體積的凝膠加樣緩沖液，用加有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠于0.5×TBE緩沖液中恒壓120-150?V電泳3h，用凝膠成像系統掃描記錄電泳結果；或于6%聚丙烯凝膠電泳上檢測；凝膠加樣緩沖液:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF；40%?(w/v)蔗糖水溶液；保留有條帶的香味純合基因型單株繼續栽培，抽穗時套袋進行自交獲得Fm代；

（E）繼續種植Fm代，種植全程施加干旱選擇壓力，存活并結實個體收獲后繼續種植，重復施加干旱壓力并自交2代后采用步驟（D）中的引物鑒定香味基因，即可獲得香味基因與抗逆基因連鎖的雜交水稻。