[發明專利]一種單寧酸免疫網絡及鹽酸克倫特羅試紙條檢測方法

有效

• 申請號: 202111462077.7
• 申請日: 2021-12-02
• 公開（公告）號: CN114113614B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 王建龍;劉思杰;張道宏;舒蕊
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/545;G01N33/543
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本發明公開了一種生物資源衍生的單寧酸支持的免疫網絡用于檢測鹽酸克倫特羅的試紙條及其應用。通過使用單寧酸納米球作為標記羊抗鼠免疫球蛋白的信號載體，偶聯特異性單克隆抗體，以免疫層析試紙條為檢測平臺構建了一種靈敏、有效且簡單的免疫層析方法，同時在無需使用任何額外的化學試劑的前提下實現了信號載體與免疫球蛋白的偶聯。得益于單寧酸的有效的蛋白富集能力，所構建的免疫網絡實現了免疫檢測的信號放大，進一步節省了特異性單克隆抗體的消耗，并因此獲得了10倍的靈敏度（以試紙條檢測截斷值為例）提升，本發明拓寬了可再生生物資源衍生的單寧酸的應用范圍，所構建的免疫網絡為向簡單、高重復性、穩定的免疫層析系統的發展提供了新的路徑。

技術領域

本發明屬生物檢測領域，具體涉及一種生物資源衍生的單寧酸免疫網絡的制備方法及以免疫層析試紙條為檢測平臺進行肉制品中鹽酸克倫特羅檢測的方法，具體涉及一種單寧酸納米球構建免疫網絡并標記特異性單克隆抗體的探針及試紙條制備，及其用于快速檢測肉制品中鹽酸克倫特羅的應用。。

背景技術

瘦肉精（clenbuterol,?CLE）作為一種人工合成的β2-腎上腺素激動劑，在過去的幾十年里不僅被用于控制支氣管哮喘和肺部疾病，還被用作促生長藥物。考慮到過量CLE攝入所引起的肌肉震顫、急性中毒、心悸等癥狀，以及CLE由于其穩定的化學性質可長期蓄積在動物體內的研究現狀，食物中CLE的殘留因此對人體健康構成了巨大威脅。同時許多國家已經明確禁止使用克侖特羅作為生長促進劑或制定了嚴格的限量標準。相比于已經開發的各種分析技術，包括高效液相色譜（HPLC），氣相色譜-質譜（GC-MS），液相色譜串聯質譜（LC-MS），毛細管電泳，電化學傳感器和酶聯免疫吸附檢測（ELISA），免疫層析試紙條（LFIA）因其具備良好的特異性，穩定性，快速性，便攜性，易于操作和低成本的優點，逐步成為在食品安全現場檢測中的實用工具。然而，實現更高的靈敏度、更簡單的抗體標記方式、更少的核心試劑消耗（如特異性單克隆抗體），仍是提高LFIA應用實際意義的重要途徑。

鑒于鹽酸克倫特羅的試紙條檢測屬于競爭性免疫學測定，檢測方法本身所具備的檢測靈敏度主要由信號輸出強度和抗體使用濃度這兩個因素決定，而現階段大多數研究僅致力于信號輸出強度的研究，關于結合納米材料替代膠體金構建免疫網絡以減少抗體使用濃度從而提升靈敏度的研究較少。一方面，通過使用納米材料替代膠體金提升了信號標簽本身的穩定性和信號強度，另一方面結合免疫球蛋白構建免疫網絡，進一步減少了特異性單克隆抗體的消耗，促使限量的抗體與游離的分析物和固定化的抗原之間產生高效的競爭，從而獲得更加靈敏的信號強度和分析物濃度的響應關系。因此，在偶聯方式簡單（簡單攪拌即可偶聯且無需調整pH）、減少核心試劑單克隆抗體消耗量、輸出足夠的信號強度的前提下獲得較高的靈敏度仍是一個關鍵問題。

發明內容

針對現有技術中的缺陷和不足，本發明的目的是提供一種生物資源衍生的免疫網絡構建生物探針、檢測鹽酸克倫特羅的試紙條及應用，該免疫探針僅需聚單寧酸納米酶、羊抗鼠免疫球蛋白與單克隆抗體依次簡單混合即可制備，在保證信號輸出強度的同時，極大的降低了抗體的用量，從而提高分析系統的靈敏度，這對于監控動物源性食品中的鹽酸克倫特羅殘留具有很重要的現實意義和應用價值，可視化檢測線達到0.6?ng/mL，截斷值為2ng/mL。

為達到上述目的，本發明采取的技術方案包括：

一種基于免疫網絡的探針，包括生物資源衍生的聚單寧酸納米球（PTAN）支持的免疫網絡和特異性單克隆抗體，所述抗體為抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體。

具體的，聚單寧酸納米球（PTAN）作為信號載體與羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI）以6mg：20?μg的混合比在1?mL去離子水中首先制備免疫網絡，隨后加入2?μg抗體通過簡單混合制備免疫探針。

具體的，所述的生物資源衍生的PTAN采用甲醛輔助交聯法，在堿性乙醇水溶液中通過攪拌、水熱反應制備，平均粒徑約為131?nm。

一種檢測鹽酸克倫特羅的試紙條，所述的試紙條上運行上述的基于免疫網絡的新型探針。