[發明專利]一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202111457358.3
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114058640A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 吳轉娣;吳才文;馮璐;昝逢剛;羅正英;劉新龍;劉家勇;趙麗萍;趙勇;姚麗;胡鑫;覃偉;楊昆;趙培方;趙俊;夏紅明;張靜;任生林
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 昆明盛鼎宏圖知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53203
• 代理人: 胡璇

1.一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）甘蔗胚性愈傷組織的誘導：從甘蔗植株上切下甘蔗莖頂端，取幼嫩的甘蔗輪生葉片，甘蔗輪生葉片置于愈傷組織誘導培養基上，甘蔗輪生葉片為愈傷組織培養物，愈傷組織培養物在黑暗環境中培養，在30-60天后，選擇活性高的淡黃色質硬的胚性愈傷組織為誘導愈傷組織，在農桿菌浸染前，將愈傷組織培養物切碎；

（2）農桿菌的活化：農桿菌培養，離心收集體外培養的農桿菌菌體，用浸染培養基重懸，獲得浸染液；

（3）胚性愈傷組織的浸染：收集步驟（1）中所獲得的愈傷組織培養物，將愈傷組織培養物放入步驟（2）中獲得的浸染液中，在黑暗環境中輕輕搖勻，搖勻時間為0.5-2.0小時，將農桿菌懸液去除，愈傷組織轉移到培養皿中，用濾紙吸干多余的農桿菌懸液，在超凈工作臺中，風干30分鐘至表面沒有水分；

（4）浸染培養：將步驟（3）中獲得的浸染過的愈傷組織培養物轉移到共培養基中，在28℃黑暗環境中，共培養7-10天，完成浸染的過程；

（5）浸染過的胚性愈傷組織的篩選：將步驟（4）中被浸染完成的愈傷組織培養物轉移到篩選培養基中，在28±2℃黑暗環境中孵化20-40天，獲得抗性愈傷組織，轉入再生培養基中，在光照培養箱中培養，獲得分化芽；

（6）分化再生過程：將步驟（5）中獲得的抗性愈傷中分化的芽移入生根培養基中，在光照培養箱中培養20天，將每個芽中的單芽移入新鮮生根培養基中培養15-25天，即可以取抗性苗的葉片，進行分子檢測分析，移栽到土壤中。

2.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（1）中，甘蔗輪生葉片的橫截面為1-2 mm的薄片，愈傷組織培養物在25-28℃的黑暗環境中培養，每10-15天更換新鮮的愈傷組織誘導培養基。

3.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（2）中，農桿菌培養至對數生長期OD₆₀₀濃度0.5-1.0，浸染培養基重懸采用搖床培養，28±2℃搖床培養0.5-2.0小時，搖床培養后加入1.0-3.0% 纖維素酶R-10+0.5-1.0% 離析酶R-10+0.4-1.0%果膠酶Y-23。

4.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（5）中，光照培養箱的溫度設置為28±2℃，光照強度為5000-8000Lux，培養時間為10-30天。

5.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（6）中，分子檢測分析的方法可以從DNA水平和RNA水平通過PCR的方法檢測外源基因是否已導入甘蔗基因組中。

6.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（6）中，分子檢測分析的方法可以通過QRT-PCR的方法檢測外源基因的表達量變化的情況。

7.根據權利要求1所述的一種高效的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，其特征在于：所述組織誘導培養基為：MS+ 30 g/L 蔗糖 + 2 mg/L 2,4-D + 8 mg/L 卡拉膠；

浸染培養基為：1/5 MS+30 g/L蔗糖+30 g/L葡萄糖+100m mol乙酰丁香酮；

共培養基為：MS +1.0 mg/L 2,4-D + 30 g/L 蔗糖 + 8 g/L 卡拉膠 + 200 mg/L 特美汀；

篩選培養基為：MS +2.0 mg/L 2,4-D + 8 g/L 卡拉膠 + 200 mg/L 特美汀 + 5 g 蔗糖 + 0.01-0.1% Basta；

再生培養基為：MS +1.0 mg/L 6-BA + 8 g/L 卡拉膠 +200 mg/L 特美汀 +5 g 蔗糖+ 0.01-0.1% Basta；

生根培養基為：MS + 2 mg/L NAA + 8 g/L 卡拉膠 + 300 mg/L 特美汀 + 5 g 蔗糖+ 0.01-0.1% Basta。