[發明專利]一種瞬時轉化提高蘋果砧木綠枝扦插生根的方法

在審

• 申請號: 202111410766.3
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114150015A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 李旭;杜睿胤;鄭清波;劉慶麗;王康;鮑澤洋
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/06;A01H6/74;A01G2/10
• 代理公司: 重慶信必達知識產權代理有限公司 50286
• 代理人: 劉會鋒

本發明公開了一種基于瞬時轉化提高蘋果砧木綠枝扦插生根的方法，涉及蘋果砧木綠枝扦插生根技術領域。本發明瞬時轉化提高蘋果砧木扦插生根的方法包括以下步驟：(1)構建35S:MdMIR156a6過表達載體，轉化農桿菌(GV3101)；(2)蘋果綠枝插穗的選取制作及預侵染的培養液；(3)設置菌液OD600濃度為0.6，抽真空壓強為0.8Mpa，時間為5min。本發明通過以農桿菌(GV3101菌株)攜帶35S:MdMIR156a6表達載體通過抽真空的方式，實現了瞬時轉化蘋果成齡期砧木小金海棠當年生新捎莖皮，從而提高其綠枝扦插生根率，本發明通過使用阿司匹林溶液的浸泡，實現了對綠枝扦插的發芽率提高，從而能夠能大幅縮短緩苗期，防止苗木干枯，提高苗木的成活率。

技術領域

本發明屬于蘋果砧木綠枝扦插生根技術領域，特別是涉及一種瞬時轉化提高蘋果砧木綠枝扦插生根的方法。

背景技術

我國蘋果栽培面積232.38萬公頃，產量4388.23萬噸，分別占世界的48％和54％，種植規模居世界之首，矮化密植集約化生產是蘋果產業發展的重要趨勢，也是現代蘋果栽培制度和模式的主要改革方向，自根砧矮化苗木繁育成為蘋果矮化密植產業亟待解決的技術問題，自根砧矮化苗木分為實生自根砧和營養系自根砧苗木，實生自根砧苗木后代嚴重分離，苗木整齊度、矮化性難以保證，而營養系自根砧苗木可保持母株的優良性狀，矮化性整齊一致，適合機械化作業，剪枝管理相對容易，是高標準建園的首選矮化苗木類型，因此，自根砧苗木的繁育技術對于蘋果矮化密植產業意義重大。現有方法無法瞬時轉化蘋果成齡期砧木小金海棠當年生新捎莖皮，提高其綠枝扦插生根率，同時苗木的成活率低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種瞬時轉化提高蘋果砧木綠枝扦插生根的方法，以解決了現有的問題：現有方法無法瞬時轉化蘋果成齡期砧木小金海棠當年生新捎莖皮，提高其綠枝扦插生根率。

為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明為一種瞬時轉化提高蘋果砧木綠枝扦插生根的方法，所述瞬時轉化提高蘋果砧木扦插生根的方法包括以下步驟：

(1)構建35S:MdMIR156a6過表達載體，轉化農桿菌(GV3101)；

(2)蘋果綠枝插穗的選取制作及預侵染的培養液；

(3)設置OD600濃度為0.4；

(4)把目標基因轉入蘋果綠枝插穗組織，向(3)中的溶液中施加壓強進行真空環境作業，抽真空壓強為0.8Mpa，時間為5min；

(5)緩慢釋放真空，使包含有目標基因的農桿菌(GV3101)細胞滲透蘋果綠枝插穗中；

(6)蘋果綠枝插穗侵染后的進行共培養，實現目標基因的瞬時過量表達；

(7)綠枝扦插(2g/L)IBA處理1min。

進一步地，所述步驟(2)中蘋果綠枝插穗母株的年齡采用成齡期階段的植株，蘋果綠枝插穗攜帶miR156基因。

進一步地，蘋果綠枝插穗需要洗凈去除污物,用50％的乙醇溶液進行消毒1min，再在次氯酸鈉水溶液浸泡20min消毒，最后用無菌水漂洗3次。

進一步地，所述步驟(4)的溶液中施加壓強為0.8Mpa的真空環境，時間控制為5min。

進一步地，所述步驟(3)中OD600的最佳濃度控制在0.6。

進一步地，所述步驟(5)的滲透過程需要持續一段時間。

進一步地，所述步驟(6)中的共培養需要保持2d，其中培養條件為23℃，濕度相對保持在85％。

進一步地，所述步驟(7)綠枝扦插時，用0.01％的阿司匹林溶液浸泡插條，能顯著提高發芽率。