[發(fā)明專利]一種鑒定產毒型艱難梭菌及其毒素基因分型的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111405745.2 | 申請日： | 2021-11-24 |
| 公開（公告）號： | CN114214437A | 公開（公告）日： | 2022-03-22 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陶亮;金大智 | 申請（專利權）人： | 西湖大學 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/145 |
| 代理公司： | 北京金信知識產權代理有限公司 11225 | 代理人： | 李維盈;范繼晨 |
| 地址： | 310024 浙江省*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 鑒定 產毒型 艱難 及其 毒素 基因 方法 | ||
1.一種用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合，所述特異性引物和探針的組合包括以下引物和探針：
引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’
引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’
tcdB1/2探針T4：5’-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-3’
tcdB3/4探針T19：5’-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-3’
引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’
引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’
tcdB2/4探針T27：5’-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-3’
引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’
引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’
通用探針C19：5’-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-3’
其中，tcdB1/2探針T4、tcdB3/4探針T19、tcdB2/4探針T27和通用探針C19各自帶有熒光報告基團以實現彼此區(qū)分。
2.根據權利要求1所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合，其中，所述tcdB1/2探針T4、tcdB3/4探針T19、tcdB2/4探針T27和通用探針C19的5’端帶有熒光報告基團，3’端帶有熒光淬滅基團。
3.根據權利要求1或2所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合，其中，所述特異性引物和探針的組合包括以下引物和探針：
引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’
引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’
tcdB1/2探針T4：5’FAM-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-TAMRA 3’
tcdB3/4探針T19：5’VIC-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-BHQ1 3’
引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’
引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’
tcdB2/4探針T27：5’ROX-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-BHQ2 3’
引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’
引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’
通用探針C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’。
4.一種用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的試劑盒，該試劑盒包括：如權利要求1-3中任一項所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合。
5.根據權利要求4所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的試劑盒，其進一步包括執(zhí)行實時熒光定量PCR擴增反應所需的試劑。
6.一種鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的方法，其包括使用如權利要求1-3中任一項所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合進行檢測的步驟。
7.根據權利要求6所述的鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的方法，包括以下步驟：
(1)從待檢測的樣本中提取DNA；
(2)使用如權利要求1-3中任一項所述的用于鑒定艱難梭菌以及對艱難梭菌毒素分型的特異性引物和探針的組合，以步驟(1)中DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增反應；
(3)根據實時熒光定量PCR儀判讀各擴增反應的Ct值進行鑒別。
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