[發明專利]一種定量檢測勿忘我中蕪菁花葉病毒的引物和方法

在審

• 申請號: 202111372579.0
• 申請日: 2021-11-18
• 公開（公告）號: CN113897462A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 姚林伶;秦姣;張石寶;胡虹;王華
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 馬曉青

本發明公開了一種定量檢測勿忘我中蕪菁花葉病毒的引物和方法，屬于植物病害檢測技術領域。本發明所用引物基于蕪菁花葉病毒CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831保守區域設計，所述引物如下：上游引物TuMV?F:5’?CGACCATACATGCCACGACA?3’，下游引物TuMV?R：5’?TCCATCCAAGCCGAACGAA?3’，無論是RT?PCR還是RT?qPCR擴增均可用此引物。用于定量檢測勿忘我中蕪菁花葉病毒的方法，包括以下步驟：提取勿忘我感病葉片總RNA；將總RNA反轉錄成cDNA，一次為模板進行普通PCR和實時熒光定量PCR。本發明設計的引物靈敏度高、特異性強、重復度好，本發明建立了一套能快速靈敏檢測蕪菁花葉病毒的方法，可為勿忘我TuMV的早期監測和預警提供技術支持。

技術領域

本發明屬于植物病害檢測技術領域，具體地說，涉及一種快速定量檢測勿忘我中蕪菁花葉病毒的引物和方法。

背景技術

勿忘我又名雜種補血草(Limonium sinuatum)。該種花色豐富，有紫、粉、白、藍、黃等多種顏色，觀賞性較高，其花瓣呈蠟質，可用作鮮切花和干花，在世界各地廣泛種植。自1991年將勿忘我引入昆明栽培后，勿忘我產業迅速發展，已成為云南省花卉栽培產業的主力軍之一。目前，大批量生產的勿忘我主要來自于組織培養，病毒在多次繼代培養中不斷積累，大大制約了勿忘我產業的發展。病毒病的頻繁發生導致勿忘我種質退化，產量和品質大不如前。采用高效、準確的檢測方法對勿忘我病毒進行及時診斷，是解決勿忘我產業發展問題的關鍵。

國內外關于補血草屬植物病毒的報道主要集中在上世紀90年代。陳燕芳等報道了勿忘我上存在蠶豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染，張仲凱記載了一種云南昆明地區發生的“勿忘我皺縮病”，經電鏡負染后，觀察到球形病毒粒體(直徑約20nm)，但目前仍不清楚其具體病原。據國外的一些報道，黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus，ClYVV)、補血草病毒(Statice virusY，StaVY)、蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、鳳仙花壞死斑病毒(Impatiensnecrotic spot virus，INSV)和葡萄屬阿爾及利亞潛伏病毒(Grapevine Algerian latentvirus，GALV)均能侵染補血草。近年來，在云南昆明勿忘我主栽區(云南省晉寧縣和宜良縣等地)，多次發現勿忘我新型病株，主要表現出典型的病毒病癥狀，如矮化、葉片皺縮、花葉等。在此之前，本發明人已通過酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)以及普通RT-PCR對采自云南昆明勿忘我主栽區的感病植株進行了病毒種類的檢測，發現云南勿忘我主栽區主要存在TuMV侵染。

TuMV隸屬于馬鈴薯Y病毒科，有文獻報道，TuMV可侵染多達43科156屬的300多種植物，其寄主范圍非常廣泛，自然條件下，主要通過蚜蟲或植株的汁液傳播。植株一旦感病，便難以恢復正常的生長。因此，在勿忘我種苗生產中對其進行及時有效的檢測具有非常重要的意義。當前用于病毒檢測的常用方法主要有生物學、顯微形態觀察、免疫學、分子生物學等方法。生物學方法存在周期長，操作繁瑣的問題，且待植物表現出相應的癥狀時，已造成無法挽救的傷害。顯微觀察的方法能直觀的看到病毒粒體，但操作相對復雜，且耗時較長。免疫學方法如ELISA則存在靈敏度低、特異性差等特點。普通PCR只能對病毒進行定性或半定量分析，不能排除假陽性的結果的出現。熒光實時定量PCR(real-time fluorescencequantitative PCR)是一種新的病毒檢測技術，具有良好的發展前景。采用該方法，可實現病毒的定量檢測，并且靈敏度較高。但目前還沒有TuMV實時熒光定量PCR檢測方法的相關技術研究及應用報道。

發明內容