[發明專利]一種藍莓天然酵母Bob1及其篩選方法和應用

在審

• 申請號: 202111370897.3
• 申請日: 2021-11-18
• 公開（公告）號: CN114196557A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 曾令文;孫如夢;吉姆·哈迪;張愛華;呼和濤力;孫小強
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/02;C12G3/024;C12R1/84
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈;李玉娜

1.一種藍莓天然酵母Bob1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.23757。

2.如權利要求1所述的一種藍莓天然酵母Bob1的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)取新鮮藍莓無菌破碎處理后密閉，置于生化培養箱中培養，待有CO₂產生后，取發酵液用無菌水稀釋，得到稀釋液；

(2)將上述步驟(1)得到的稀釋液涂布于含有氯霉素的沙保羅下層培養基中，在通風條件下恒溫培養后，置于沙保羅上層培養基中，在密閉環境中避光倒置培養1-3h；

(3)挑取顯深紅色的菌株，接種于酵母固體培養基上，在通風條件下恒溫培養，選取具有典型酵母特征的單菌落，進行3-4次平板劃線，得到單個菌落接種至酵母固體培養基中培養，稀釋后接種至鑒別培養基上純化培養，挑取純菌株，并對純菌株進行鏡檢；

(4)采用試劑盒提取法提取上述步驟(3)得到的純菌株的基因組DNA，以ITS1和ITS4為引物，PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到基因序列；

(5)進行生長性能分析和理化性質分析，篩選得到藍莓天然酵母Bob1。

3.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中培養的條件為：培養溫度28-30℃，培養時間1-3d，所述發酵液與無菌水的稀釋比例為1-2:1-2，優選1:1。

4.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中恒溫培養條件為：培養溫度28-30℃，培養時間24-28h，所述稀釋液的濃度為10^-4-10^-6。

5.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(3)中恒溫培養條件為：培養溫度28-30℃，培養時間1-3d，所述稀釋后菌種的濃度為10^-4-10^-6。

6.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(3)中鏡檢的具體操作為：將挑取的純菌種經草酸銨結晶紫染色，再置于顯微鏡下觀察細胞形狀，大小及繁殖方式。

7.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(4)中PCR擴增的體系為：總體積20μL，順序加入PrimestarMax 10μL，引物ITS1和ITS4各0.5μL，基因組DNA 0.3μL，無菌水8.7μL。

8.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(4)中PCR擴增的過程為：98℃預變性5min，98℃變性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，共31次循環，最后10℃充分延伸5min。

9.一種藍莓果酒，其特征在于所述藍莓果酒由如權利要求1所述的藍莓天然酵母Bob1發酵釀造得到的。

10.如權利要求1所述的藍莓天然酵母Bob1在藍莓果酒發酵中的應用。