[發明專利]駱駝凝乳酶原突變蛋白及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 202111365704.5
• 申請日: 2021-11-18
• 公開（公告）號: CN113801867B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 王楠;楊彩峰;彭華康;郭文芳;王夢琪;李剛強;劉德虎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍

本發明公開了駱駝凝乳酶原突變蛋白及其編碼基因和應用。所述駱駝凝乳酶原突變蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No.1?4所示，其編碼基因的核苷酸序列分別為SEQ ID No.5?8所示。本發明在駱駝凝乳酶原的自切割前導肽區域設計并分別突變四個氨基酸位點產生四個N?糖基化保守序列，分別將其進行分泌表達時，突變點的區域分別形成一個N?糖基化保守位點，使重組駱駝凝乳酶原的分泌表達水平顯著提高，同時這些位點突變并不影響前導肽的自切割活性，且突變位點不在成熟蛋白上，因此不影響凝乳酶的凝乳活性。本發明駱駝凝乳酶原突變蛋白編碼基因在畢赤酵母菌株中的表達量顯著提升，在無需改變發酵生產工藝的條件下有效降低生產成本。

技術領域

本發明涉及凝乳酶突變蛋白及其應用，尤其涉及駱駝凝乳酶原突變蛋白及其編碼基因，本發明進一步涉及駱駝凝乳酶原突變蛋白編碼基因在制備重組駱駝凝乳酶中的應用，屬于駱駝凝乳酶原突變蛋白及其應用領域。

背景技術

凝乳酶（EC3.4.23.4）屬于天冬氨酸蛋白酶家族，主要來源于未斷奶哺乳動物的胃黏膜細胞，能夠特異性的切割K-酪蛋白中Phe₁₀₅和Met₁₀₆之間的肽鍵，破壞酪蛋白在水溶液中的穩定性，從而使乳液中的酪蛋白凝結而析出。凝乳酶是奶酪生產中的關鍵酶制劑，除了動物來源的凝乳酶外，還有植物和微生物來源的凝乳酶，但由于植物和微生物凝乳酶對酪蛋白具有明顯的非特異性水解作用，生成較多的短肽使凝乳效率下降并產生苦味，因此，動物來源的凝乳酶被認為是奶酪生產中品質最好的凝乳酶種類。

隨著世界范圍內凝乳酶消耗量的增加，通過宰殺幼年哺乳動物提取凝乳酶的傳統方法已不能滿足需求，因此，利用轉基因的方法獲得重組動物凝乳酶成為工業凝乳酶的重要來源。微生物表達的牛凝乳酶是商業化應用最為廣泛的重組動物凝乳酶，其它重組表達的凝乳酶還包括水牛、山羊、羔羊和駱駝等來源的，這些凝乳酶的氨基酸序列具有一定的同源性，分子量在35kDa到45kDa之間，但他們的作用底物具有一定的特異性，例如牛凝乳酶不能作用于駱駝奶，但駱駝凝乳酶既可以作用于駱駝奶，也可以作用于牛奶。在哺乳動物體內，凝乳酶都以凝乳酶原的形式分泌到胃中，在胃液的酸性環境下，凝乳酶原通過自我剪切去掉N端的前導肽而自我激活，產生凝乳活性。研究表明，牛凝乳酶原在pH2.0條件下，能夠自我剪切掉N-端42個氨基酸，生成成熟的凝乳酶。在重組表達的情況下，前導肽對于活性是必須的，重組表達的成熟凝乳酶沒有活性。重組的凝乳酶原需經過體外酸性-中和處理后才能夠完成自我剪切過程并轉變成具凝乳活性的成熟凝乳酶。