[發(fā)明專利]一種CAR-T細(xì)胞凍存用保護(hù)劑及凍存方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111364595.5
• 申請(qǐng)日: 2021-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN113841690A
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李廣超;石連兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李廣超
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開了一種CAR?T細(xì)胞凍存用保護(hù)劑，包括培養(yǎng)基和添加在培養(yǎng)基中的以下成分：泡桐素、煙酸肌醇酯、冬瓜籽提取物、羥基酪醇、β?葡聚糖、胰島素、谷胱甘肽。本發(fā)明提供的保護(hù)劑由培養(yǎng)基和添加在培養(yǎng)基中的泡桐素、煙酸肌醇酯、冬瓜籽提取物等成分組成，其中泡桐素有助于減少凍存過(guò)程中冰晶的大小，降低對(duì)細(xì)胞的損傷。煙酸肌醇酯、冬瓜籽提取物有助于CAR?T細(xì)胞在凍存過(guò)程中保持穩(wěn)定性，減少細(xì)胞凋亡。上述成分和羥基酪醇、β?葡聚糖、胰島素、谷胱甘肽一起為CAR?T細(xì)胞的凍存過(guò)程提供保護(hù)作用，使凍存的CAR?T細(xì)胞活率高，細(xì)胞活性幾乎不受影響。本發(fā)明還提供一種CAR?T細(xì)胞的凍存方法，采用本發(fā)明的保護(hù)劑，操作簡(jiǎn)便，有效降低CAR?T細(xì)胞的凍存成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞領(lǐng)域，尤其涉及一種CAR-T細(xì)胞凍存用保護(hù)劑及凍存方法。

背景技術(shù)

實(shí)體腫瘤是腫瘤患者死亡的主要原因，手術(shù)、放療和化療這一類傳統(tǒng)療法近幾年有很大的進(jìn)展，但這種療法對(duì)身體有極大負(fù)擔(dān)，并且在發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移之后，無(wú)論采取何種傳統(tǒng)療法，都是很難徹底治愈。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，免疫細(xì)胞治療成為治療腫瘤的新手段。

CAR-T療法就是嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，這是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法，近幾年通過(guò)優(yōu)化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，是一種非常有前景的，能夠精準(zhǔn)、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤免疫治療方法。

T淋巴細(xì)胞（T lymphocyte）簡(jiǎn)稱T細(xì)胞，是由來(lái)源于骨髓的淋巴干細(xì)胞，在胸腺中分化、發(fā)育成熟后，通過(guò)淋巴和血液循環(huán)而分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能。在實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)人員通過(guò)基因工程技術(shù)，將T細(xì)胞激活，并裝上定位導(dǎo)航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），將T細(xì)胞這個(gè)普通“戰(zhàn)士”改造成“超級(jí)戰(zhàn)士”，即CAR-T細(xì)胞，他利用其“定位導(dǎo)航裝置”CAR，專門識(shí)別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)免疫作用釋放大量的多種效應(yīng)因子，它們能高效地殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療惡性腫瘤的目的。

無(wú)論是將CAR-T細(xì)胞用于過(guò)繼性免疫治療還是其他科研實(shí)驗(yàn)，都需要體外擴(kuò)增出出足夠數(shù)量的細(xì)胞，在大量擴(kuò)增培養(yǎng)后，為了方便細(xì)胞長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸，需要將細(xì)胞進(jìn)行超低溫凍存。在超低溫凍存過(guò)程中為了保證細(xì)胞活性，在凍存過(guò)程中需要使用保護(hù)劑，防止細(xì)胞在凍存和復(fù)蘇過(guò)程中受到冰晶損傷、脫水和吸水損傷。目前使用較多的凍存保護(hù)劑配方中需添加二甲基亞砜、自體血漿等，這種凍存保護(hù)劑雖然可以維持細(xì)胞的活性，但是由于二甲基亞砜具有一定的細(xì)胞毒性，安全性上欠佳，自體血漿取材有限，當(dāng)大量細(xì)胞擴(kuò)增凍存時(shí)，無(wú)法滿足使用需求。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種CAR-T細(xì)胞凍存用保護(hù)劑，有效提高CAR-T細(xì)胞的凍存時(shí)間，并保障經(jīng)凍存后的細(xì)胞活性滿足使用要求。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種CAR-T細(xì)胞的凍存方法。

本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種CAR-T細(xì)胞凍存用保護(hù)劑，包括培養(yǎng)基和添加在培養(yǎng)基中的以下成分：泡桐素、煙酸肌醇酯、冬瓜籽提取物、羥基酪醇、β-葡聚糖、胰島素、谷胱甘肽。

優(yōu)選地，各成分在培養(yǎng)基中的終濃度為：泡桐素1-5ng/mL、煙酸肌醇酯2-8μg/mL、冬瓜籽提取物1-3μg/mL、羥基酪醇12-16ng/mL、β-葡聚糖10-14μg/mL、胰島素4-9μg/mL、谷胱甘肽5-10μg/mL。

優(yōu)選地，各成分在培養(yǎng)基中的終濃度為：泡桐素3ng/mL、煙酸肌醇酯5μg/mL、冬瓜籽提取物2μg/mL、羥基酪醇14ng/mL、β-葡聚糖12μg/mL、胰島素7μg/mL、谷胱甘肽8μg/mL。

優(yōu)選地，所述冬瓜籽提取物的制備過(guò)程如下：取冬瓜籽粉碎后加入5-10倍重量的水進(jìn)行浸提，浸提溫度為80-100℃，浸提時(shí)間為3-5h，浸提三次，收集浸提液，過(guò)濾后減壓蒸餾，冷凍干燥得冬瓜籽提取物。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為RPMI1640。