[發明專利]基于CRISPR/Cas9體系編輯本氏煙基因的載體及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202111362595.1
• 申請日: 2021-11-17
• 公開（公告）號: CN114045304B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 李方方;周雪平;趙斯文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N15/113;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/82;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.一種基于CRISPR/Cas9體系編輯本氏煙基因的載體的構建方法，其特征在于：所述本氏煙基因為NbbZIP60基因，如SEQ?ID?NO:4所示；針對本氏煙NbbZIP60基因編碼區序列靠近5’端的PAM位點設計特異性靶向NbbZIP60的gRNA，構建pCambia?1300-BKG-g1載體；

包括以下步驟：

(1)設計能夠特異性靶向本氏煙內源基因NbbZIP60的gRNA，合成兩條單鏈gRNA，如SEQID?NO：1-2所示，然后經退火后合成互補雙鏈；

(2)用限制性內切酶Eco31I線性化BKG載體，純化回收；

(3)用T4?DNA連接酶連接線性化的BKG載體與雙鏈化的gRNA；

(4)轉化DH5α大腸桿菌，篩選鑒定陽性克隆，陽性克隆質粒測序，獲得正確插入gRNA的BKG載體。

2.權利要求1所述構建方法獲得的基于CRISPR/Cas9體系編輯本氏煙基因的載體。

3.權利要求2所述的基于CRISPR/Cas9體系編輯本氏煙基因的載體在本氏煙的瞬時表達或穩定遺傳表達的應用。

4.權利要求2所述的基于CRISPR/Cas9體系編輯本氏煙基因的載體在抵御雙生病毒侵染中的應用，其特征在于：所述雙生病毒為TYLCCNV/TYLCCNB。

5.根據權利要求2所述載體獲得的農桿菌侵染性克隆菌株，其特征在于：將獲得的載體質粒轉化EHA105農桿菌，獲得農桿菌侵染性克隆菌株。