[發明專利]一種α-鵝膏蕈堿人工抗原、單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用

有效

• 申請號: 202111356985.8
• 申請日: 2021-11-16
• 公開（公告）號: CN113980909B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 胥傳來;周升陽;匡華;徐麗廣;孫茂忠;吳曉玲;劉麗強;馬偉;朱建平;郝昌龍;宋珊珊;胡擁明;吳愛紅;郭玲玲;胥欣欣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K7/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/47;G01N33/577;G01N33/53;C12R1/91
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明提供了一種α?鵝膏蕈堿人工抗原、單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用，屬于食品安全免疫檢測領域。以α?鵝膏蕈堿與高碘酸鈉反應得到具有醛基的產物為半抗原，并與載體蛋白偶聯，得到完全抗原，得到一株單克隆抗體雜交瘤細胞株，此細胞株分泌的單克隆抗體，同時對α?鵝膏蕈堿和β?鵝膏毒肽具有較好的檢測靈敏度，IC₅₀值分別為0.5ng/mL和1ng/mL，可實現對食品中α?鵝膏蕈堿和β?鵝膏毒肽殘留量的檢測，為食品中α?鵝膏蕈堿和β?鵝膏毒肽殘留的免疫檢測提供了原料，對于食物中毒的毒源鑒定、蘑菇中毒預防和中毒后的針對性治療具有實際應用價值。本發明合成步驟簡潔有效，完全可用于免疫分析中。

技術領域

本發明涉屬于食品安全免疫檢測技術領域，尤其是指一種α-鵝膏蕈堿人工抗原、單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用。

背景技術

在全球范圍內，每年報告數千起蘑菇中毒事件，因此蘑菇食物中毒一直以來是我國重點關注的食品安全問題之一。大約80％的蘑菇中毒涉及未知的蘑菇種類。大多數致命病例歸因于含有毒素的蘑菇。鵝膏毒肽(amatoxins，AMA)是一個雙環八肽家族，在極端溫度、pH值、烹飪或人體消化酶作用下不會失活。引起毒性的主要毒素是鵝膏毒素，最顯著的是α-鵝膏毒素(α-AMA)和β-鵝膏毒肽(β-AMA)。它們是RNA聚合酶II的有效抑制劑，與RNA聚合酶Ⅱ的RBP1亞基結合形成一個復合體,使RBP1亞基降解，導致mRNA轉錄、阻止真核生物中的蛋白質合成。新鮮蘑菇中活性鵝膏毒素的人體LD50(估計為主要有毒鵝膏毒素的總含量)被認為約為0.1mg/kg。

此外，鵝膏毒肽引起的食物中毒易誤診且缺乏針對性治療，因此早期診斷對于鵝膏毒肽中毒的救治尤為重要。

目前α-鵝膏蕈堿和β-鵝膏毒肽的檢測方法主要分為儀器分析方法，包括毛細管電泳法(CE)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)等。其中LC-MS/MS能實現毒素的高通量精確分析而成為目前最主要的方法。已有的方法具有靈敏度高，檢測限低，可比性和重復性好等優點,但存在檢測通量低、假陽性、靈敏度低和基質效應嚴重等問題，嚴重限制了其在實驗室以外作業中的應用。

因此制備α-鵝膏蕈堿抗體，建立免疫分析檢測方法快速而有效地檢測樣品中的α-鵝膏蕈堿和β-鵝膏毒肽對于食物中毒的毒源篩查、蘑菇中毒注意事項和中毒后的康復治療具有重要意義。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種α-鵝膏蕈堿人工抗原、單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用。

一株分泌α-鵝膏蕈堿單克隆抗體的雜交瘤細胞株，已于2021年05月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為單克隆細胞株FML，保藏編號為CGMCC No.22336，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

一種α-鵝膏蕈堿的半抗原，所述半抗原的結構式為：

在本發明的一個實施例中，所述的α-鵝膏蕈堿的半抗原的制備方法，包括以下步驟：將α-鵝膏蕈堿溶于有機溶劑中，加入高碘酸鈉水溶液，室溫避光攪拌反應得到所述α-鵝膏蕈堿的半抗原α-AMA。

在本發明的一個實施例中，所述有機溶劑為DMF或DMSO。

在本發明的一個實施例中，所述α-鵝膏蕈堿與高碘酸鈉質量比為2-8：5-30。

將α-鵝膏蕈堿的半抗原α-AMA溶液加入載體蛋白，室溫黑暗攪拌。最后，加入硼氫化鈉(NaBH₄)(0.1M，在10mM氫氧化鈉溶液中)，下在黑暗中攪拌；然后用PBS溶液透析，除去未反應的α-鵝膏蕈堿的半抗原，得到α-鵝膏蕈堿包被原/免疫原(α-AMA-SP-Pro/α-AMA-SP-Pro)。