[發明專利]一種用于重組蛋白的高糖基化修飾序列及其重組豬促卵泡激素和應用

在審

• 申請號: 202111347600.1
• 申請日: 2021-11-15
• 公開（公告）號: CN114213523A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 劉昕;賴強;王弋;韓慶月;羅維方;郭偉麗;鄭飛;吳培楓
• 申請（專利權）人: 廣州源博醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C07K1/107;C07K19/00;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 沈素芹

本發明屬于蛋白重組的技術領域，具體涉及一種用于重組蛋白的高糖基化修飾序列及其重組豬促卵泡激素和應用。所述高糖基化修飾序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，經畢赤酵母密碼子優化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。所述重組豬促卵泡激素為豬促卵泡激素的重組蛋白，其為豬促卵泡激素基因與高糖基化修飾序列進行重組融合得到；將本發明經優化的高糖基化修飾序列與豬FSH融合得到重組蛋白，對該蛋白進行畢赤酵母密碼子優化修飾后進行高效表達，適度的糖基化修飾以及二硫鍵的形成提高了重組FSH蛋白的生物學活性和蛋白穩定性，能夠高效刺激動物卵巢的增重，具有優異的生物學活性。

技術領域

本發明屬于蛋白重組的技術領域，具體涉及一種用于重組蛋白的高糖基化修飾序列及其重組豬促卵泡激素和應用。

背景技術

垂體促卵泡雌激素，又稱為促卵泡素(FSH)，是一種由垂體前葉分泌的可刺激卵泡發育和成熟，促進精子生成的激素，屬于糖蛋白激素家族。豬促卵泡素(pFSH)蛋白大小為35.5kDa，兩個亞基α和β的一級結構分別包含121和131個氨基酸，其中N端的前24和20個氨基酸序列為信號肽。在同一物種中，糖蛋白激素家族都是由共同的α亞基和激素特異性的β亞基組成的異源二聚體，而β亞基則具有激素特異性，決定激素的特定的生理功能，其生物學活性主要由β亞基決定。FSHβ基因在哺乳動物中具有較高的保守性，FSHβ同源性在80％以上，豬源FSHβ與人源FSHβ同源性92％。FSH的β亞基具有兩個N-型糖基化位點，其糖基化修飾會影響二硫鍵的形成，進而影響結構的穩定性，同時糖基化修飾的程度影響FSH的生物學活性。現有研究顯示去掉多糖鏈會降低其刺激細胞產生cAMP的能力，適度的糖基化修飾能夠提高FSH的穩定性及生物學活性。

在生殖生理上FSH作用于雌性動物可刺激卵巢生長，增加卵巢重量，刺激卵泡生長發育，FSH對卵巢的作用是通過卵泡的顆粒細胞進行調節的，顆粒細胞表面存在FSH受體。FSH主要應用于輔助生殖領域和畜牧行業，功能主要是在胚胎移植過程中誘導超數排卵，治療卵巢囊腫及性欲缺乏等。在動物生產上FSH常用于誘導雌性動物的發情和超數排卵，治療卵巢機能疾病，提高家畜的繁殖力；自然條件下，FSH主要存在于動物垂體和絕經期女性尿液。目前畜牧生產用的FSH主要是從各種家畜的腦垂體組織提取純化出來的，較常用的是豬垂體FSH。由于FSH與LH的結構相似，且存在結構不均一性，垂體中成分復雜，動物腦垂體組織容易攜帶病毒，純化較為困難，限制了FSH的廣泛應用。天然激素制劑在具有由于受提取原料的限制生產效率低、雜質不易純化、易污染外源病毒、提取的半衰期短且活性不穩定等原因。重組FSH能夠避免天然激素制劑在應用過程中的不足，體外重組表達FSH為新型激素制劑的生產提供了新的途徑。通過基因工程手段及相關分子生物學技術來表達和生產重組FSH蛋白是一種經濟、高效的方法。

現有的長效性修飾主要為糖基化修飾策略及長效元件的融合表達，不同的糖基化修飾策略及長效元件的選擇，表達量、生物活性、半衰期均有不同程度的差別，合適的糖基化修飾策略及長效元件尤為重要。前期的研究主要集中FSH中的原核表達和酵母表達、CHO細胞表達，FSH及相關融合蛋白的原核表達生產工藝存在包涵體變復性、難以形成二硫鍵、需脫內毒素等復雜流程。現有研究中在CHO細胞表達中表達量低，生產成本高，難以應用于臨床。在畢赤酵母中的表達具有低成本、二硫鍵形成及糖基化修飾等優勢，但表達的FSH蛋白及其類似物活性均不高，表達量低于10mg/L。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種用于重組蛋白的高糖基化修飾序列及其重組豬促卵泡激素和應用，利用高糖基化序列與FSH的串聯表達，通過適度的糖基化修飾及融合蛋白策略顯著提高FSH的生物活性及延長半衰期。

本發明的技術內容如下：

本發明提供了一種用于重組蛋白的高糖基化修飾序列，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，經畢赤酵母密碼子優化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述高糖基化修飾序列用于蛋白重組融合，高糖基化修飾序列的數量為1個或以上；