[發明專利]一種單純皰疹病毒1型、2型和偽狂犬病毒三重熒光定量PCR檢測組合物、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202111341777.0
• 申請日: 2021-11-12
• 公開（公告）號: CN113846190B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發明（設計）人: 宋佳;馬明明;郭振華;李剛;龐咪
• 申請（專利權）人: 河南省人民醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種單純皰疹病毒1型、2型和偽狂犬病毒三重熒光定量PCR檢測組合物，其特征在于，由單純皰疹病毒1型UL49基因的上游引物HSV-1-UL49F、下游引物HSV-1-UL49R和探針HSV-1-UL49P，單純皰疹病毒2型gG基因的上游引物HSV-2-gGF、下游引物HSV-2-gGR和探針HSV-2-gGP，偽狂犬病毒UL24基因的上游引物PRV-UL24F、下游引物PRV-UL24R和探針PRV-UL24P組成；

所述引物和探針的序列如下：

上游引物HSV-1-UL49F：GGTTCCGCGCGATGAG；

下游引物HSV-1-UL49R：GGGACTCGCCATACATGAAGA；

探針HSV-1-UL49P：VIC-ACGAGGATCTGTACTACAC-MGB；

上游引物HSV-2-gGF：CTACCACGCGTCGCTTTTG；

下游引物HSV-2-gGR：ATAAACGTGCGGCCCGTAA；

探針HSV-2-gGP：FAM-TCCCCAGAGCCTGCT-MGB；

上游引物PRV-UL24F：CTTCCCCGAGAGACGCTTAA；

下游引物PRV-UL24R：CCCGAGGTTGACTTCAAAGG；

探針PRV-UL24P：CY5-AAGGCGTCCTTGACC-MGB。

2.一種包含權利要求1所述的檢測組合物的三重熒光定量PCR檢測試劑盒。

3.如權利要求2所述的三重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，由試劑A、試劑B和試劑C組成；試劑A為熒光定量PCR反應預混液，包含探針法FastFire快速定量PCR試劑、內參染料ROX Reference Dye、權利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的三組引物、探針和無菌無酶水；試劑B為陽性對照，包含標準質粒對照品pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24；試劑C為陰性對照，為Tris-EDTA緩沖液。

4.如權利要求3所述的三重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述標準質粒對照品pUC57-UL49，濃度為5.0×10⁴拷貝/微升；標準質粒對照品pUC57-gG，濃度為4.3×10⁴拷貝/微升；標準質粒對照品pUC57-UL24，濃度為4.3×10⁴拷貝/微升。

5.一種用于非診斷目的的三重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的DNA模板；

(2)采用權利要求1所述的檢測組合物建立三重熒光定量PCR反應體系；

(3)進行熒光定量PCR檢測；

(4)待測樣品的結果分析。

6.如權利要求5所述的三重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述三重熒光定量PCR反應體系為25μL，包含20μL的試劑A和5μL的模板；所述模板為待測樣品的DNA、陽性對照標準品或陰性對照標準品。

7.如權利要求6所述的三重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述20μL的試劑A包括探針法FastFire快速定量PCR試劑12.5μL、內參染料ROX Reference Dye 0.25μL、權利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的6種引物的反應終濃度均為0.2μM、3種探針的反應終濃度均為0.15μM，余量為無菌無酶水。

8.如權利要求7所述的三重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述反應體系的反應條件為98℃預變性60s，98℃變性5s，60℃退火15s，40個循環。