[發(fā)明專利]一種篩選谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的方法、采用該方法篩選出的抑制劑及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111328929.3
• 申請(qǐng)日: 2021-11-10
• 公開（公告）號(hào): CN114107426B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張洪建;周志蕓;段澤琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02;G01N33/68;A61K31/55;A61K31/513;A61P35/00
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種篩選谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的方法，并基于該人源谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑篩選體系篩選出了一種新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑米安色林，為米安色林拓展了新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明公開了米安色林的新用途，該化合物有助于臨床上針對(duì)多種腫瘤預(yù)防和治療藥物的開發(fā)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的方法、采用該方法篩選出的抑制劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)增殖和轉(zhuǎn)移過程中的生物合成和氧化還原需求，會(huì)重新調(diào)整細(xì)胞代謝，以滿足能量(葡萄糖)、氨基酸、脂肪酸和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。研究表明，干擾或阻斷某些代謝途徑(例如谷氨酰胺代謝)可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤療法的耐藥。谷氨酰胺是血漿中最豐富的非必需中性氨基酸，可以由飲食分解獲得或者在肌肉、肝臟、脂肪組織、肺和大腦中生成，是許多代謝過程中的關(guān)鍵中間體，包括能量形成、氧化還原穩(wěn)態(tài)、大分子合成和信號(hào)傳遞等。在快速生長(zhǎng)或疾病期間，細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的需求會(huì)超過其供應(yīng)，谷氨酰胺便會(huì)從非必需氨基酸變?yōu)楸匦璋被幔虼四[瘤細(xì)胞谷氨酰胺成癮是一種代謝補(bǔ)償，間接促進(jìn)了氧化糖酵解，以便在缺氧不利條件下為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和能量。

谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵步驟是SLC1A5(ASCT2)介導(dǎo)的細(xì)胞攝取：SLC1A5是Na⁺依賴的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，是腫瘤微環(huán)境(TME)中腫瘤細(xì)胞的代謝弱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，SLC1A5的抑制或缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量降低，使其缺乏能源物質(zhì)，最終導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制。因此，在腫瘤細(xì)胞中，阻斷或減少谷氨酰胺的攝取，可能達(dá)到抑制住腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性。基于這個(gè)假設(shè)，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC1A5作為潛在新型靶點(diǎn)，探討通過調(diào)控SLC1A5轉(zhuǎn)運(yùn)功能治療癌癥的可能性。

SLC1A5是特異性谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)體，目前已經(jīng)開發(fā)出一些SLC1A5攝取轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺的抑制劑，而開發(fā)新型的基于小分子化合物的SLC1A5抑制劑意義重大，將為腫瘤的治療提供更多的藥物和方法。該轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的設(shè)計(jì)及篩選可以通過某些表達(dá)SLC1A5的腫瘤細(xì)胞完成。但這種篩選方法具有特異性差、通量低、成本高的缺點(diǎn)，因此建立一種合理的抑制劑篩選體系意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種人源SLC1A5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并應(yīng)用此細(xì)胞株建立了一種篩選方法，篩選出了一種新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑。

本發(fā)明中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑通過人源SLC1A5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行篩選，該細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括以下步驟：將人源化SLC1A5基因插入至HEK293細(xì)胞中得到的細(xì)胞株，具體的，

(1)將hSLC1A5基因與pcDNA5-TO(Hygromycin/Ampicillin)表達(dá)載體組裝，構(gòu)建pcDNA5-TO-hSLC1A5質(zhì)粒；其中，從基因庫獲得hSLC1A5基因序列(NM_005628.3)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

(2)將步驟(1)構(gòu)建的pcDNA5-TO-hSLC1A5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，使用潮霉素B篩選出陽性克隆，并確認(rèn)細(xì)胞株同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)人源SLC1A5基因及其蛋白，即構(gòu)建出所述人源SLC1A5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

本發(fā)明采用HEK293細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，HEK293為人胚胎腎細(xì)胞，發(fā)明人通過生化特性檢查發(fā)現(xiàn)HEK293中缺乏大部分的代謝酶、攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，且HEK293細(xì)胞具有培養(yǎng)周期短、背景較低、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，選擇該細(xì)胞系進(jìn)行篩選體系的構(gòu)建，經(jīng)過與其他多種轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的對(duì)比，驗(yàn)證HEK293細(xì)胞為最優(yōu)選擇。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)的酶切位點(diǎn)為NotI和XbaI。