[發明專利]車前草花葉病毒的檢測卡、檢測引物組合物、GICA-RT-LAMP試劑盒

有效

• 申請號: 202111324342.5
• 申請日: 2021-11-09
• 公開（公告）號: CN113846095B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 張玉寶;謝忠奎;楊果;王亞軍;郭志鴻;邱陽;蘇學思
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北生態環境資源研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6844;G01N33/543;G01N33/558;G01N33/569
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 覃蛟

1.一種檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，其包括車前草花葉病毒的檢測卡和檢測車前草花葉病毒的RT-LAMP檢測引物組合物，所述檢測卡包括在襯板上依次設置的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述膠體金結合墊上含有膠體金-車前草花葉病毒抗體的結合物，所述硝酸纖維素膜上沿層析方向依次設置有檢測T線和質控C線，所述檢測T線包被有PlAMV的抗體IgG，所述質控C線包被有抗PlAMV抗體的二抗；所述檢測T線上PlAMV的抗體IgG的包被量為每2mm線寬上包被1.5～2.0μg蛋白；所述抗PlAMV抗體的二抗的包被量為每2mm線寬上包被1.5～2.0μg蛋白；

所述膠體金結合墊上的車前草花葉病毒抗體的包被量為每毫升膠體金中含14-16μg的車前草花葉病毒抗體；

所述檢測引物組合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向內引物FIP和SEQ ID NO.4所示的反向內引物BIP，所述引物組合物還包括SEQ ID NO.5所示的正向環引物LF和SEQ ID NO.6所示的反向環引物LB。

2.根據權利要求1所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述檢測卡還包括由下殼體和上殼體組成的卡槽，所述襯板與所述下殼體的一個端面固定連接，所述上殼體與所述下殼體固定連接，且所述上殼體與所述下殼體留有放置所述襯板的安裝腔。

3.根據權利要求2所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述上殼體上間隔設置有加樣窗和反應觀察窗，所述加樣窗空間上位于所述樣品墊的上方，所述反應觀察窗空間上位于所述硝酸纖維素膜的上方。

4.根據權利要求2所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述上殼體與所述下殼體通過卡扣結構卡接。

5.根據權利要求1所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RT-LAMP擴增反應試劑，所述RT-LAMP擴增反應試劑包括反轉錄酶、RNase抑制劑、dNTP混合物、ThermoPol反應緩沖液、MgSO₄、DNA 聚合酶和水。

6.根據權利要求5所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，所述反轉錄酶選自AMV反轉錄酶或M-MLV反轉錄酶。

7.根據權利要求5所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，所述DNA 聚合酶選自Bst DNA聚合酶。

8.根據權利要求5所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括磷酸緩沖液、磷酸洗滌緩沖液、熒光染料檢測液、陰性對照品和陽性對照品。

9.根據權利要求8所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述陰性對照品為水，所述陽性對照品為車前草花葉病毒外殼蛋白CP基因片段標準品。

10.一種采用如權利要求1-9任一項所述的檢測車前草花葉病毒的GICA-RT-LAMP試劑盒檢測車前草花葉病毒的檢測方法，其特征在于，其包括：

（1）取待測溶液置于車前草花葉病毒的檢測卡的樣品墊上，觀察檢測T線和質控C線的顏色變化，初次判斷待測樣品中是否含有車前草花葉病毒PlAMV；

（2）若根據步驟（1）無法鑒別待測樣品中是否含有車前草花葉病毒PlAMV，進行反轉錄RT-LAMP擴增：將步驟（1）免疫富集反應后檢測卡上的檢測T線取下，以取下的檢測T線作為模板，利用RT-LAMP檢測引物組進行RT-LAMP擴增；根據RT-LAMP擴增反應產物二次判斷待測樣品中是否含有車前草花葉病毒。