[發明專利]一種流感嗜血桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202111323161.0
• 申請日: 2021-11-04
• 公開（公告）號: CN114790489B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 李論;高利芬;方治偉;肖華鋒;陳利紅;李甜甜;周俊飛;彭海;萬人靜
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12N15/11;G16B20/20;G16B25/20;G16B30/10;G16B40/10;G16B50/30;C12R1/21
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 潘行

本發明公開了一種流感嗜血桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用，所述MNP標記位點是指在流感嗜血桿菌基因組上篩選的區分于其他物種且在物種內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域，包括MNP?1～MNP?12的標記位點；所述引物如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.24所示。所述MNP標記位點能特異的鑒定流感嗜血桿菌并精細的區分不同的亞型；所述引物互不干擾，綜合多重擴增和測序技術，可一次性對多樣本的所有標記位點進行序列分析，具有高通量、多靶點、高靈敏和免培養的優勢，可應用于大規模樣本的流感嗜血桿菌的鑒定和遺傳變異檢測，對流感嗜血桿菌的科研和監測具有重要意義。

技術領域

本發明實施例涉及生物技術領域，特別涉及一種流感嗜血桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用。

背景技術

流感嗜血桿菌(Haemophilus?influenzae)是嗜血桿菌屬中最常見的對人有致病性的細菌，較廣泛地寄居于健康人體的鼻、咽、眼及陰道黏膜中，常與正常菌群共生，是社區獲得性肺炎的重要病原菌。其可在流感及其他病毒性感染時形成繼發性感染，如支氣管炎、鼻竇炎、中耳炎等，多發生在成年人中；亦可引起一些原發性化膿性感染，如化膿性腦膜炎、鼻咽炎、化膿性關節炎等，常發生在兒童中。在發展中國家，流感嗜血桿菌每年引起200萬～300萬例肺炎，致病者大多數為b型流感嗜血桿菌。流感嗜血桿菌和其他病原引起的呼吸道感染的臨床癥狀非常相似，因而很難通過臨床表現來準確判斷患者是否感染了流感嗜血桿菌。因此，快速、準確的流感嗜血桿菌的檢測和分型，對于及時診斷病因，做到精準治療具有重要意義。另外，流感嗜血桿菌也是實驗室進行研究常用的模式病原微生物。其作為群體生物，在和宿主、環境的互作中，群體內個體會發生變異。對于實驗室的研究來說，這種不易被察覺的變異會導致不同實驗室或同一實驗室不同時期相同命名的菌株實際上并不相同，導致實驗結果的不可重現和不可比較。人Hella細胞實驗室間的異質性已經導致大量的實驗結果的不可比較和數據浪費。因此，開發快速、準確的、可監測變異的流感嗜血桿菌檢測分析方法對于流感嗜血桿菌的科學研究和應用都具有重要意義。

經典的流感嗜血桿菌檢測方法，包括分離培養、PCR技術、全基因組和宏基因組測序等，在時長、操作復雜度、檢測通量、檢測變異的準確性和靈敏度、成本等方面存在一個或多個局限。融合超多重PCR擴增和高通量測序的靶向分子標記檢測技術，可以在低微生物含量的樣本中靶向的富集目標微生物，避免了全基因組測序需要的分離培養步驟和宏基因組測序帶來的大量數據浪費和背景噪音，具有樣本需要量少、診斷結果精確，節約數據量、檢測低頻變異的優勢。

現有的靶向檢測技術檢測的分子標記主要包括SNP和SSR標記。SSR標記是公認的多態性最高的標記，但在微生物中數量少；SNP標記數量巨大，分布密集，是二態性標記，單個SNP標記的多態性不足以捕獲微生物種群中潛在的等位基因多樣性。

因此，開發病原微生物流感嗜血桿菌的高多態性的新型分子標記及其檢測技術，成為亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明目的是提供一種流感嗜血桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用，可以對流感嗜血桿菌進行定性鑒定和變異檢測，具有多靶標、高通量、高靈敏和精細分型的效果。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

在本發明的第一方面，提供了一種流感嗜血桿菌的MNP標記位點，所述MNP標記位點為在流感嗜血桿菌基因組上篩選的物種特異的、且在物種內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域，包括L42023基因組上MNP-1～MNP-12的標記位點。

上述技術方案中，MNP-1～MNP-12的標記位點具體如說明書表1所示，表1中標注的所述MNP標記的起始和終止位置是基于L42023序列確定的。

在本發明的第二方面，提供了一種用于檢測所述MNP標記位點的多重PCR引物組合物，所述多重PCR引物組合物包括12對引物，所述12對引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.24所示。