[發明專利]一種煙草NtSLAC1基因突變體及分子鑒定方法和應用

有效

• 申請號: 202111315431.3
• 申請日: 2021-11-08
• 公開（公告）號: CN113930432B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 白戈;謝賀;張慧;蘇家恩;李勇;楊大海;逄濤;鄒聰明;費明亮;范志勇;劉家紅;徐天養
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12Q1/6895
• 代理公司: 成都市鼎宏恒業知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51248
• 代理人: 吳錦德

本發明公開了一種煙草NtSLAC1基因突變體及分子鑒定方法和應用，所述煙草NtSLAC1基因突變體為Ntslac1?1，其為煙草NtSLAC1基因第57位的G突變為A，形成終止密碼子，使該基因提前終止；所述基因突變體Ntslac1?1的核苷酸序列如SEQ?ID?N0.2所示。本發明通過系統研究，首次提出了一種煙草NtSLAC1基因突變體及分子鑒定方法和應用，本發明提出的降低煙草煙葉中氯離子含量的NtSLAC1基因突變體Ntslac1?1獲得的煙草植株，煙葉中氯離子含量比對照降低51.4％，使煙葉的氯離子含量顯著降低。

技術領域

本發明涉及植物分子生物學技術領域，更具體地，涉及一種煙草NtSLAC1基因突變體及分子鑒定方法和應用。

背景技術

氯離子含量是煙草中重要的質量參數，煙葉中的氯離子含量以0.3％～0.8％作為合適，如果煙葉中氯離子含量過高，會影響卷煙制品的燃燒性，會造成卷煙制品的陰燃，從而會使卷煙制品的煙氣中具有更多的一氧化碳及焦油，這樣會危害消費者的健康。并且當氯離子含量更高的時候，會直接造成熄火的現象。

目前我國在種植蔬菜和糧食作物的時候，會使用大量的化肥農藥，現在的化肥中含量大量的氯離子，而這些含有氯離子的化肥在使用的過程中會造成耕作土壤中氯離子含量的超標。而土壤氯離子含量的超標會造成栽培作物過量的吸收氯離子從而造成作物體內的氯離子含量超標，這樣會影響農作物的品質。

為解決煙葉氯離子含量偏高的問題，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考慮到低氯化肥的生產成本要顯著的高于高氯含量化肥，因此化肥生產廠家與農民考慮到成本的因素，往往不會使用低氯化肥而使用高氯離子含量的化肥。另外現在中國的耕作土壤中氯離子含量超標已經較為嚴重，即便現在開始使用低氯離子含量的化肥也不能很快的解決作物尤其是煙草中氯離子超標的問題；因此傳統的農藝措施很難改變目前煙葉中氯離子超標的問題。

因此，鑒于以上情況，有必要研究一種煙草NtSLAC1基因突變體及分子鑒定方法和應用以解決上述技術問題。

發明內容

本發明的第一個目的在于獲得降低煙草煙葉中氯離子含量的煙草NtSLAC1基因突變體，第二個目的在于提供煙草NtSLAC1基因突變體Ntslac1-1的分子鑒定方法，第三個目的在于上述煙草NtSLAC1基因突變體在降低煙草煙葉中氯離子含量的應用。

本發明的第一個目的是這樣實現的，所述煙草NtSLAC1基因突變體為Ntslac1-1，其為煙草NtSLAC1基因第57位的G突變為A，形成終止密碼子，使該基因提前終止；所述基因突變體Ntslac1-1的核苷酸序列如SEQ?ID?N0.2所示。

本發明的第二個目的是這樣實現的，NtSLAC1基因突變體Ntslac1-1的分子鑒定方法，所述突變體Ntslac1-1的DNA片段是由以下引物對擴增得到，所述引物對的上游引物為NtSLAC1?F，其核苷酸序列如SEQ?ID?N0.3所示；下游引物為NtSLAC1?R，其核苷酸序列如SEQID?N0.4所示。

本發明的第三個目的是這樣實現的，所述的煙草NtSLAC1基因突變體Ntslac1-1在降低煙草煙葉中氯離子含量的應用。

本發明還提供一種NtSLAC1基因突變體的制備方法，該制備方法包括如下步驟：

1、EMS誘變煙草種子：

先將煙草種子用次氯酸鈉清洗消毒，然后用蒸餾水洗干；再將煙草植株用磷酸緩沖液浸泡，以增加種子的萌發率；將浸泡獲得的煙草種子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10-15小時，然后進行離心濾干煙草種子。將離心濾干的煙草種子用蒸餾水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，將EMS廢液用氫氧化鈉處理，以免造成污染。

2、篩選獲得突變體植株：

首先提取突變體煙草DNA；以突變體材料的DNA為模板設計特異引物進行PCR擴增；