[發明專利]一種檢測胰島素的電化學適配體傳感器及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 202111315217.8
• 申請日: 2021-11-08
• 公開（公告）號: CN114034748A
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 常竹;劉瑾瑾;朱碧澄;朱旭;郝遠強;張銀堂;徐茂田
• 申請（專利權）人: 商丘師范學院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張真真

1.一種檢測胰島素的電化學適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下：

(1)AuNPs-Apt探針的制備：將HAuCl₄水溶液在攪拌下加熱至沸騰，然后加入檸檬酸鈉溶液，回流煮沸，將所得AuNPs溶液冷卻至室溫，然后再加入Apt溶液，低溫孵育，得到AuNPs-Apt探針溶液；

(2)AuNPs修飾電極的制備：將電極依次進行拋光，打磨，清洗并干燥后，用HAuCl₄水溶液通過it法制備電極/AuNPs；

(3)電化學適配體傳感器的制備：將Apt溶液滴在電極/AuNPs上，用封閉液孵育，得到電極/AuNPs-Apt。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(1)中Apt的序列為5’-SH-GGT GGT GGG GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTC-3’，HAuCl₄水溶液的質量體積比濃度為0.01％-0.02％，檸檬酸鈉溶液的質量體積比濃度為2％-8％，HAuCl₄水溶液與檸檬酸鈉溶液的體積比為(50-100)：1，煮沸時間為15-20min，AuNPs溶液與Apt溶液的體積比為(1-2)：19，其中Apt溶液的濃度為50-100μM，孵育溫度為2-8℃，孵育時間為16-24h。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中電極為激光打印石墨烯電極或玻碳電極，拋光粉為Al₂O₃拋光粉，Al₂O₃拋光粉粒徑為0.3、0.05μm，HAuCl₄水溶液濃度為35-45mM，it法的電位為-0.18--0.22V，時間為160-200s。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中Apt溶液濃度為4-6μM，電極為激光打印石墨烯電極或玻碳電極，激光打印石墨烯電極封閉液為牛血清白蛋白溶液，玻碳電極封閉液為巰基己醇溶液，其中牛血清白蛋白溶液的質量體積比濃度為1％-2％，巰基己醇溶液的濃度為8-10mM。

5.權利要求1所述的方法制備的檢測胰島素的電化學適配體傳感器，其特征在于：包括用于特異性識別胰島素的適配體Apt、水解電極表面未與胰島素結合的多余Apt的核酸外切酶Ⅰ、金納米顆粒標記的探針溶液AuNPs-Apt、AuNPs修飾的電極；其中Apt通過Au-S鍵修飾在電極/AuNPs表面,經封閉液封閉非特異性活性位點后，形成電極/AuNPs-Apt。

6.權利要求5所述的檢測胰島素的電化學適配體傳感器的使用方法，其特征在于，步驟如下：

a.將電極/AuNPs-Apt傳感器先后浸泡于胰島素的標準溶液、核酸外切酶Ⅰ溶液和AuNPs-Apt探針溶液中孵育，經沖洗后得到電極/AuNPs-Apt/insulin/AuNPs-Apt電化學適配體傳感器。

b.將電極/AuNPs-Apt/insulin/AuNPs-Apt電化學適配體傳感器浸泡在含有亞甲基藍溶液的Tris-HCl緩沖溶液中，調節pH后，清洗并作為工作電極，在Tris-HCl緩沖溶液中進行電化學DPV檢測，根據所得的峰電流大小與胰島素的標準溶液之間的關系，繪制工作曲線；

c.檢測原待測樣品的濃度，然后向其中添加胰島素，按照a、b操作進行檢測，將檢測出來的電流信號帶入步驟b得到的工作曲線，得到待測樣本中胰島素的濃度。

7.根據權利要求6所述的檢測胰島素的電化學適配體傳感器的使用方法，其特征在于：所述步驟a中電極為激光打印石墨烯電極或玻碳電極，激光打印石墨烯電極/AuNPs-Apt浸泡在一系列濃度為0.05pM-1μM的胰島素的標準溶液中，玻碳電極/AuNPs-Apt浸泡在一系列濃度為0.02pM-5.0μM的胰島素的標準溶液中，胰島素溶液中孵育時間為40-60min，核酸外切酶Ⅰ溶液的濃度為1.25-1.50U/μL，孵育溫度為36-38℃，孵育時間為2.5-3.0h，探針溶液中孵育時間為15-25min。

8.權利要求6所述的檢測胰島素的電化學適配體傳感器的使用方法，其特征在于：所述步驟b中亞甲基藍溶液的濃度為30-50μM，Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.95-0.15M，Tris-HCl緩沖溶液pH值為7.3-7.5，浸泡時間為10-20min。