[發明專利]水稻耐冷基因OsICE2在提高水稻耐冷性的應用

在審

• 申請號: 202111312999.X
• 申請日: 2021-11-08
• 公開（公告）號: CN113881687A
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 張振宇;黨姝;楊祥波;于曉明;王曉航
• 申請（專利權）人: 吉林農業科技學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 支思迪

本發明涉及水稻育種技術領域，具體涉及水稻耐冷基因OsICE2在提高水稻耐冷性的應用，通過酶切法基于克隆水稻耐冷基因OsICE2構建pCsV1300?OsICE2過表達載體，利用農桿菌介導法創制OsICE2轉基因水稻。經過低溫脅迫處理后，測定轉基因水稻的干重和存活率；實驗結果表明，水稻OsICE2基因可提高水稻對冷脅迫的耐受性，為提高水稻耐冷性，實現水稻在低溫條件大面積種植提供了重要依據與材料，也為開發耐冷基因方面的研究提供了實例。

技術領域

本發明涉及水稻育種技術領域，具體涉及水稻耐冷基因OsICE2在提高水稻耐冷性的應用。

背景技術

水稻作為三大糧食作物之一，廣泛分布于世界各地。到目前為止，種植面積已達1.8億公頃，是重要的糧食作物之一。水稻是對冷敏感的喜溫作物，導致水稻生長過程中對環境提供熱量的要求更加嚴格。因此，當生長環境溫度過低時，會對水稻的生長造成壓力，水稻在生長發育過程中，長時間或短時間處在低于其生長適宜溫度的環境中時，會損害代謝和生理功能的正常運行，造成發育異常，并影響水稻的產量和品質，嚴重情況下，甚至會導致植株死亡。低溫冷害是世界水稻主產區普遍存在的問題，水稻生長發育過程中如果遇到低溫冷害的氣象災害，不但會對水稻生產有較大危害，對其產量和品質的形成也會造成較大影響。中國東北、日本和韓國東亞稻區為代表，低溫冷害問題尤為突出。粳稻作為東北地區的主栽品種，品質較好食味值較高，需求量較大，作為商品糧出售經濟效益較高，逐漸成為了中國北方稻區發展的特色，在發展優質、高產、高效農業中具有重要意義。

農桿菌介導法對水稻進行遺傳轉化是目前主要的水稻轉化方法。農桿菌能在自然條件下趨化性的將T-DNA插入到植物基因組中，以此為基礎的農桿菌介導法轉化率高，轉基因單拷貝比例高，且轉化子穩定。關于水稻轉基因的研究多為提高水稻耐鹽性、抗病性等方面，水稻耐冷方面研究甚少，是值得轉基因育種探索的一個重要方向。

發明內容

為解決上述問題，本發明克隆了水稻OsICE2基因，并構建OsICE2過表達載體，利用農桿菌介導法創制OsICE2轉基因水稻，為提高水稻耐冷性，實現水稻在低溫條件大面積種植提供了重要依據與材料，也為開發耐冷基因方面的研究提供了實例。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

水稻耐冷基因OsICE2在提高水稻耐冷性的應用，通過酶切法基于克隆水稻耐冷基因OsICE2構建pCsV1300-OsICE2過表達載體，利用農桿菌介導法創制OsICE2轉基因水稻；具體包括如下步驟：

S1、克隆水稻耐冷基因OsICE2

S1.1 水稻RNA的提取

將培養5天后出現水稻根和芽的水稻種子4℃低溫處理2 h后，剪取芽0.2 g，使用Trizol法進行RNA提取；

S1.2反轉錄獲得水稻cDNA

去除RNA中殘留的基因組DNA并反轉錄獲得cDNA，反轉錄體系為：Total RNA 2.5 μg； Anchored 0.5μL；Oligo(dt)18Primer(0.5μg/μL) 5μL ；2×Ts Reation Mixg 0.5μL；DNA Remover 0.5μL；RNase-Free Water 補齊至10μL；反應條件為：PCR中42℃孵育30 min，85℃加熱5秒鐘失活TransScript RT/RI Enzyme Mix和gDNA Remover；

S1.3 OsICE2基因的獲得

用Primer Premier5.0軟件進行引物設計，控制TM值保持58%，GC含量40%-60%，設計OsICE2的克隆引物OsICE2-clone-F和OsICE2-clone-R；根據pCsV1300上面的酶切位點，對OsICE2基因的側翼引入XbaI、EcoRI酶切位點，PCR擴增制備水稻OsICE2基因的編碼區，其中，OsICE2的克隆引物序列：

OsICE2-clone-F: 5' ATGGACGAGGCGGAGG 3'