[發(fā)明專利]一種利用高活性肌肉干細胞制備細胞培養(yǎng)肉的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111312728.4
• 申請日: 2021-11-08
• 公開（公告）號: CN114134105B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 牟曉東;牟艷玲;甘元善;戴曉宇;李棟;姚慶強;劉蕾
• 申請（專利權）人: 山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N13/00
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種利用高活性肌肉干細胞制備細胞培養(yǎng)肉的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）篩選高活性肌肉干細胞；

（2）采用水凝膠單層細胞的方法獲得高活性肌肉干細胞：利用加入Follistatin的細胞培養(yǎng)基質進行大規(guī)模的細胞擴增；水凝膠中結合有Jagged1蛋白的多肽片段；

（3）獲得肌肉干細胞水凝膠薄層的立體多層結構；

（4）高效獲得分化為成熟肌肉纖維細胞的立體結構組織，即細胞培養(yǎng)肉；

所述步驟（1）的過程為：提取并培養(yǎng)來自健康年輕動物個體的肌肉干細胞MPC，運用流式細胞儀對有較高的ALDH1酶活性的細胞進行篩選，并進行常規(guī)2D表面的培養(yǎng)來初步擴增；

所述的步驟（1）還包括將來自動物的原代的肌肉干細胞初步培養(yǎng)擴增到5x10⁴細胞數(shù)量后，根據(jù)其ALDH1的活性進行分離篩選，分離出15%的ALDH1活性最高的細胞；

所述步驟（2）的過程為：將處于對數(shù)生長期的第4到6代的ALDH1高表達肌肉干細胞導入膠原蛋白形成的水凝膠薄層結構，利用加入Follistatin的細胞培養(yǎng)基質進行大規(guī)模的細胞擴增；水凝膠中結合有Jagged1蛋白的多肽片段，來刺激肌肉干細胞Notch1信號通道的激活，從而誘導肌肉干細胞保持干細胞特性和加快生長如此培養(yǎng)5-7天；

所述步驟（3）的過程為：用細胞鏟將肌肉干細胞的水凝膠單層從培養(yǎng)液中取出，鋪于新的培養(yǎng)盤中，層層疊加將4-6層的細胞單層摞在一起，加入含有Follistatin的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)靜置培養(yǎng)；

所述步驟（4）的過程為：將肌肉細胞的立體多層結構換成肌肉細胞成肌分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6-10天，所述培養(yǎng)液中加入Follistatin；同時在培養(yǎng)體系中施加間歇性的低頻率的電刺激，來促進肌肉干細胞分化為成熟肌肉纖維細胞。

2.根據(jù)權利要求1所述的利用高活性肌肉干細胞制備細胞培養(yǎng)肉的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中水凝膠薄層結構的厚度為1.5-2.5mm厚度；水凝膠中Jagged1蛋白的多肽片段的濃度為0.2-1.0mg/mL；加入Follistatin的3D細胞培養(yǎng)基質中Follistatin為Follistatin?344，濃度為100-200ng/mL。

3.根據(jù)權利要求1所述的利用高活性肌肉干細胞制備細胞培養(yǎng)肉的方法，其特征在于，所述步驟（3）中培養(yǎng)3-6天。

4.根據(jù)權利要求1所述的利用高活性肌肉干細胞制備細胞培養(yǎng)肉的方法，其特征在于，所述步驟（4）中培養(yǎng)液中的Follistatin為Follistatin?344，濃度為100-200ng/mL；電刺激：頻率20?Hz，時間：30-50?分鐘，每天兩次；所述的培養(yǎng)液是DMEM細胞培養(yǎng)基，添加劑包括胎牛血清最終體積分數(shù)為1-3%、雞胚胎精華提取物最終體積分數(shù)為0.5-2%；細胞培養(yǎng)基的總體積是10mL培養(yǎng)液/CM³細胞骨架。