[發明專利]一種人類椎間盤PROCR+

在審

• 申請號: 202111298175.1
• 申請日: 2021-11-02
• 公開（公告）號: CN114107183A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 甘翼搏;劉鵬;胡歐;朱軍;晏蒲林;黃莎;林鵬
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍特色醫學中心
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 重慶鼎慧峰合知識產權代理事務所(普通合伙) 50236
• 代理人: 朱浩

1.一種人類椎間盤PROCR⁺髓核祖細胞的分離方法，其特征在于，包括：

1)將髓核充分剪碎處理后，依次分別經胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化處理后，獲得細胞懸液；

2)將所述細胞懸液經裂解紅細胞處理并經磁珠分選去除組織雜質后，以PBS⁺0.04％BSA重懸細胞獲得細胞重懸液；

3)將所述細胞重懸液中的細胞經PE-PROCR流式抗體染色然后通過流式細胞儀分選，即得人類椎間盤PROCR⁺髓核祖細胞，所述流式細胞儀分選是通過包括下述步驟的方法實現的：

(1)創建FSC-A與SSC-A的點狀圖，劃門以去除雜質；

(2)創建FSC-H與FSC-W的點狀圖，劃門以除粘連體；

(3)創建SSC-H與SSC-W的點狀圖，再次劃門以去除粘連體；

(4)創建SSC-H與APC-Cy7的點狀圖，劃門去除死細胞；

(5)創建FSC-H與PE的點狀圖，劃門分選PROCR⁺細胞。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述胰蛋白酶消化處理是通過包括下述步驟的方法實現的：

向髓核組織中加入0.25％胰蛋白酶，每2克髓核組織需要胰蛋白酶10mL，于37℃靜音混懸器上消化30分鐘，300g/5min/4℃，離心，棄上清。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述鏈霉蛋白酶消化處理是通過包括下述步驟的方法實現的：

向經胰蛋白酶消化處理的髓核組織中加入0.2％鏈霉蛋白酶溶液，每2克髓核組織需要鏈霉蛋白酶溶液10mL，于37℃靜音混懸器上消化組織1小時，300g/5min/4℃離心，棄上清。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述Ⅱ型膠原酶消化處理是通過包括下述步驟的方法實現的：

向經鏈霉蛋白酶消化處理后的髓核組織加入0.1％Ⅱ型膠原酶溶液，每2克髓核組織需要Ⅱ型膠原酶溶液10mL，于37℃靜音混懸器上旋轉消化2個小時，在消化過程中每隔半個小時觀察消化結果，待組織基本消化完全時即停止消化。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中流式細胞儀參數配置如下：

FSC(Voltage E-1.Ampgain 7.21.Linear mode)、SSC(Voltage 271to 358.Ampgain1.00,Linear mode)主要閾值參數：FSC,value 162，輔助閾值參數：無。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中通過流式細胞儀分選PROCR⁺細胞過程中包括：

連接樣品，以最慢流速運行，然后進行數據分析，最后以MSCBM培養基接收PROCR^-和PROCR⁺細胞；

優選地，所述最慢流速運行是通過包含以下流式細胞儀的配置參數實現的：Sheetpressure 4.5PSIG,sample pressure 5.0PSIG,12μL/min。

7.根據權利要求1-6所述的制備方法得到的人類椎間盤PROCR⁺髓核祖細胞。

8.如權利要求7所述的人類椎間盤PROCR+髓核祖細胞在制備椎間盤退行性疾病的生物治療的藥物中的應用。