[發明專利]一種檢測新型冠狀病毒亞基因的熒光定量PCR方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202111294163.1
• 申請日: 2021-11-03
• 公開（公告）號: CN113801966B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 崔侖標;朱小娟;葛以躍;喬喬;吳濤;吳斌;趙康辰;朱立國;朱鳳才
• 申請（專利權）人: 江蘇省疾病預防控制中心（江蘇省公共衛生研究院）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍;孟祥斌

1.一種設計用于檢測活性新型冠狀病毒的組合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：設計靶向Leader區和/或N基因區的探針、靶向Leader區的上游引物、靶向N基因區的下游引物，所述的上游引物包括在如SEQ ID NO.7所示序列的第四位引入突變的序列，所述的突變為將A突變為G，突變后的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物包括如SEQ IDNO.2所示的序列，所述的探針包括如SEQ ID NO.3所示的序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探針5’端以FAM熒光基團標記。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探針3’端以BHQ1熒光基團標記。

4.一種用于檢測活性新型冠狀病毒的組合物，其特征在于，所述的組合物包括采用權利要求1-3任一項所述的方法設計的探針、上游引物、下游引物，其中，上游引物包括如SEQID NO.1所示的序列，下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列，探針包括如SEQ ID NO.3所示的序列。

5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述的探針5’端以FAM熒光基團標記。

6.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述的探針3’端以BHQ1熒光基團標記。

7.一種診斷新型冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含權利要求4-6任一項所述的組合物。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含至少一種反應混合物，其中所述至少一種反應混合物包含以下一種或多種：DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、陽性對照核酸、陰性對照核酸、對照引物、對照探針、內標核酸、內標核酸引物、內標核酸探針、KCl、MgCl2、乙酸鉀、緩沖液、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖、二甲基亞砜、甜菜堿、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、非離子型去污劑、銨離子、乙二胺四乙酸。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照核酸為包含新型冠狀病毒N亞基因片段的重組質粒。

10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的重組質粒的載體為pMD19-T。

11.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的新型冠狀病毒N亞基因片段序列包括如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。

12.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的內標核酸為RNaseP。

13.根據權利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述的RNaseP的上游引物包括如SEQID NO.4所示的序列，RNaseP的下游引物包括如SEQ ID NO.5所示的序列，RNaseP的探針包括如SEQ ID NO.6所示的序列。

14.根據權利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述的RNaseP的探針的5’端以HEX熒光基團標記。

15.根據權利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述的RNaseP的探針的3’端以BHQ2熒光基團標記。

16.根據權利要求7-15任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包含說明書。

17.權利要求4-6任一項所述的組合物在制備診斷新型冠狀病毒的試劑盒中的應用。

18.一種非診斷目的的檢測活性新型冠狀病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括采用權利要求4-6任一項所述的組合物配制熒光定量PCR反應體系。