[發明專利]一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法

在審

• 申請號: 202111289708.X
• 申請日: 2021-11-02
• 公開（公告）號: CN114032291A
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 葛軍輝;王亞南;許蕾;韓揚;高金龍;袁天六;陳兵
• 申請（專利權）人: 上海阿克曼醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6806
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 劉子鈺

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法；包括以下步驟：S1：對待測FFPE樣本進行基因組DNA提取，使用天根石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒DP330?02；S2：設計并合成正向引物和反向引物；S3：使用上述S2步驟中的引物對基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物檢測并回收；S4：對PCR擴增產物進行TA克隆，得到陽性克隆，挑取單克隆進行測序；S5：對測序結果去除兩端的載體序列，得到待測樣本BCOR序列信息，與理論序列比對獲得樣本中BCOR?內串聯重復的變異情況。本發明利用T?A克隆和一代測序等分子生物學常用技術，檢測BCOR基因15號外顯子編碼序列內串聯重復(ITD)變異情況。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法。

背景技術

目前，鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法主要有以下四種鑒定方法。

(1)RNA測序

其中，RNA測序的缺陷為：a.RNA提取過程復雜，福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)樣本提取質量較差，可能對檢測準確度產生不良影響；b.提取、檢測成本較高。

(2)RT-PCR法

其中，RT-PCR法的缺陷為：a.目前報道BCOR-內串聯重復第15外顯子編碼序列的3′-部分有6種不同的變異形式，長度從89-114bp不等；RT-PCR方法檢測突變類型受限。

(3)DNA甲基化分析

其中，DNA甲基化分析的缺陷為：a.平臺開展有限，檢測可及性較低；b.操作復雜，對技術人員專業要求高，檢測成本較高。

(4)液滴PCR法

其中，液滴PCR法的缺陷為：a.平臺開展有限，檢測可及性較低；b.檢測突變類型受限。

為此，提出一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法，利用T-A克隆和一代測序等分子生物學常用技術，檢測BCOR基因15號外顯子編碼序列內串聯重復(ITD)變異情況。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種基于克隆和一代測序鑒定BCOR基因15號外顯子串聯重復的方法，包括以下步驟：

S1：對待測FFPE樣本進行基因組DNA提取，使用天根石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒DP330-02；

S2：設計并合成正向引物和反向引物；

S3：使用上述S2步驟中的引物對基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物檢測并回收；

S4：對PCR擴增產物進行TA克隆，得到陽性克隆，挑取單克隆進行測序；

S5：對測序結果去除兩端的載體序列，得到待測樣本BCOR序列信息，與理論序列比對獲得樣本中BCOR-內串聯重復的變異情況。

具體的，所述S1步驟中的具體處理步驟如下：

S101：脫蠟：將蠟塊切下的蠟卷或將石蠟切片上的組織刮下裝到干凈的EP管中，向EP管中加入1mL的二甲苯，靜置五分鐘后12000rpm離心10min；倒掉二甲苯，再向EP管中加入1mL的二甲苯，12000rpm離心10min；倒掉二甲苯，向EP管中加入1mL的乙醇溶液，12000rpm離心10min；倒掉乙醇溶液，再向EP管中加入1mL的乙醇溶液，12000rpm離心10min；倒掉上清液，保留底部沉淀，放置56℃金屬浴揮發酒精；