[發明專利]優化的高產率表達多肽的表達盒

在審

• 申請號: 202111282575.3
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN113981002A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: Z·德拉吉克;S·蓋瑟;R·施米茨;B·維爾姆斯
• 申請（專利權）人: 諾華股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/113
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

提供了優化的高產率表達多肽的表達盒。具體提供了一種穩定轉染有至少一種表達盒和/或至少一種表達載體的CHO宿主細胞，其中所述至少一種表達盒和/或至少一種表達載體整合入所述宿主細胞的基因組，所述表達盒用于表達目標多肽，所述表達盒包括包含SEQ ID NO:1、2或7的5’UTR多核苷酸序列與hCD33分泌性前導序列。本發明尤其提供以高產率生成目標多肽的新型表達盒、表達載體和方法。

技術領域

本發明尤其涉及適于表達目標多肽的表達盒，其中所述表達盒包括特定的5’UTR和hCD33分泌性前導序列的組合。發現此遺傳元件的特定組合意外地引起目標多肽表達水平顯著優于其它5’UTR與其它分泌性前導序列的組合。因此，使用此表達盒有利于高產率生成目標多肽。

背景技術

大量克隆和表達目標多肽的能力變得越來越重要。生成和純化高水平蛋白的能力對于人用藥物和生物技術領域，例如合成蛋白藥物以及基礎研究例如結晶蛋白以能測定其三維結構尤其重要。其他情況下難以獲得一定量的蛋白能在宿主細胞中過表達且隨后被分離和純化。

選擇生成重組蛋白的表達系統取決于多種因素，包括目標蛋白的細胞生長特性、表達水平、胞內和胞外表達、翻譯后修飾和生物活性以及產生治療性蛋白的調節問題和經濟考慮。哺乳動物細胞相比其它表達系統如細菌或酵母的關鍵優勢是完成合適蛋白折疊、復雜N-連接糖基化和真O-連接糖基化的能力以及廣譜的其它翻譯后修飾。由于所述優勢，真核且特別是哺乳動物細胞是目前用于生成復合治療性蛋白如單克隆抗體的表達系統的選擇。

獲得高表達宿主細胞(也稱為高生產子)的最常見方法以產生合適表達載體以表達目標產物作為第一步。所述表達載體驅動編碼目標產物的多核苷酸在宿主細胞內表達且通常包括至少一個選擇標記以產生重組細胞系。除了編碼目標蛋白的多核苷酸，用于在宿主細胞內表達多肽的表達載體通常還包括適于驅動轉錄的轉錄控制元件作為表達盒元件，如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、轉錄暫停或終止信號。此外，一般包括適當翻譯控制元件且操作性連接待表達的多核苷酸，如合適的5’UTR和3’UTR。

為增加所述表達系統的效率，優化不同元件，尤其是有助于轉錄和翻譯效率、蛋白合成、ER內正確折疊和蛋白分泌的DNA序列。沒有經優化翻譯和分泌組件的高產率表達系統可能導致mRNA不穩定、蛋白質分泌不足、錯折疊(失活)蛋白積聚于細胞質或膜中。因此，對能穩定和持續翻譯并分泌正確折疊蛋白進入細胞培養基的表達系統尤其感興趣。這種分泌系統提供以下優勢：穩定和有效的mRNA翻譯；正確的蛋白折疊和有效分泌，簡單且快速的產物純化過程，以及相較胞質系統產率提高。然而，多數可用分泌系統的產物產率尚未充分優化。為提高生產率和分泌效率，一個目標是優化分泌信號(本文也稱為信號肽或分泌性前導序列)以及其與不同5’UTR序列的組合，從而獲得產生所需高水平表達的遺傳元件組合。

來自原核或真核生物的大部分分泌和膜結合蛋白具有氨基末端前導肽(也稱為分泌性前導序列或信號肽)，其在生物合成期間從新生前體多肽中切割。分泌性前導序列通常長度為5-60個氨基酸。此序列對于分泌而言是必須且充足的。分析大量這類分泌性前導序列顯示在沒有顯著氨基酸序列同源性的情況下出現的共同結構基序[Von Heijne,1981；Perlman等,1983]。一般，分泌性前導序列由帶正電荷的氨基末端(n)、疏水核(h)和極性更高的定義信號肽酶切割位點的羧基末端(c)組成。分泌性前導序列的“n”區長度為約5-8個氨基酸且特征為存在堿性殘基?！癶”區包含8-12個非極性氨基酸，其平均構成為37％亮氨酸、15％丙氨酸、10％纈氨酸、10％苯丙氨酸、7％異亮氨酸和21％疏水氨基酸如甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸。此區域形成α-螺旋的傾向高，所述構象可促進與脂雙層內部的相互作用。對分泌性前導肽結構特征的研究主要基于細菌蛋白，表明“h”區對信號序列功能關鍵[Gierasch,1990]。通過缺失或者疏水殘基被親水或帶電氨基酸取代來破壞h區可導致信號功能損失，而改變“n”區的影響不大[Bird等,1990]。羧基末端或切割區通常長度為約6個氨基酸。該區域參與信號肽酶識別和切割，一般需要其來實現蛋白的最終折疊和分泌。