[發(fā)明專利]一種蛇足石杉離體組織培養(yǎng)及保存方法

在審

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• 申請日: 2021-10-30
• 公開（公告）號: CN113854152A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設計）人: 董麗輝
• 申請（專利權）人: 董麗輝
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京棘龍知識產權代理有限公司 11740
• 代理人: 張開

本發(fā)明一種蛇足石杉離體組織培養(yǎng)保存方法，包括以下步驟：步驟一：選用不同月份采集的新鮮藥用植物蛇足石杉材料，用甜菜堿型表面活性劑浸泡20min將其洗凈后，流水沖洗6h；然后滅菌，用無菌水沖洗6遍，并將經消毒處理后外植體上的莖尖接種于不同培養(yǎng)基中。本發(fā)明在叢生苗生根研究中發(fā)現(xiàn)基本M2培養(yǎng)基相對于B5培養(yǎng)基更適宜生根，且激素IBA對根的生長有顯著性的影響，較高或較低濃度的IBA均不利于叢生苗生根，在添加10μmol/L IBA的MS培養(yǎng)基中叢生苗生根狀態(tài)最佳。

技術領域

本發(fā)明涉及蛇足石杉技術領域，具體涉及一種蛇足石杉離體組織培養(yǎng)及保存方法。

背景技術

蛇足石杉又名救命王、千層塔、金不換，屬石杉科,石杉屬，的蕨類植物，主要分布于長江流域，云南，貴州，東北及兩廣地區(qū)；蛇足石杉全草入藥，民間用于治療癰癤腫毒、跌打損傷等；近年來的研究表明蛇足石的藥效成分石杉堿甲；是一種強效的乙酰膽堿酯酶抑制劑用于治療重癥肌無力，能改善老年性記憶功能減退，與其他同類產品相比，副作用小，是一種前景非常廣闊的治療老年性癡呆癥的藥物。由于蛇足石杉的生長非常緩慢，植物資源稀少，并且全草中含石杉堿甲甚微，石杉堿甲的人工合成十分困難，石杉堿甲的來源完全依賴野生資源，迫切需要找到新的石杉堿甲的來源。

為了解決蛇足石杉的資源稀缺，國內外對蛇足石杉進行組織培養(yǎng)研究，但是由于蛇足石杉大量的真菌共生，外植體滅菌很難，至今沒有成功的組培培養(yǎng)報道，本文為了探索建立一套較好的滅菌方法我們以蛇足石杉莖尖為外植體，為進一步的組織培養(yǎng)奠定基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種蛇足石杉離體組織培養(yǎng)及保存方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種蛇足石杉離體組織培養(yǎng)保存方法，包括以下步驟：

步驟一：選用不同月份采集的新鮮藥用植物蛇足石杉材料，用甜菜堿型表面活性劑浸泡20min將其洗凈后，流水沖洗6h；然后滅菌，用無菌水沖洗6遍，并將經消毒處理后外植體上的莖尖接種于不同培養(yǎng)基中；于20℃,光照時間12h/d、光照強度1250lx,條件下培養(yǎng)2-3周；

步驟二：接種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將培養(yǎng)3周后表面無菌的外植體對應轉到添加孔雀石綠和抗生素溶液中的培養(yǎng)基上,繼續(xù)培養(yǎng)4周殺滅內生菌，最后將無菌外植體對應轉到最初各培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：121℃、104kPa滅菌20min,高壓滅菌前調pH至5.8；

步驟三：綠色小體的誘導切取經過殺滅內生菌的外植體頂芽接種至含不同濃度6-BA的M2培養(yǎng)基上，每組接種10個芽，重復3次；

步驟四：培養(yǎng)2個月后，統(tǒng)計綠色小體的誘導率；繼續(xù)在M2培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個月，統(tǒng)計GGB的增殖和叢生芽分化；

步驟五：將叢生芽，并轉至附加不同濃度IBA的改良M2和B5培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)1個月，觀察記錄其對幼芽生根的影響。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括以下重量份原料：瓊脂4.8g/L,植物生長料3.5g/L、孔雀石綠2.0g/L和抗生素1.0g/L。

優(yōu)選地，所述植物生長料為硫酸鈉、硫酸銅按照重量比(2-6):1混合組成。

優(yōu)選地，所述植物生長料為硫酸鈉、硫酸銅按照重量比4:1混合組成。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：