[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111275680.4
• 申請(qǐng)日: 2021-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114107078A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳強(qiáng);劉登輝;向景;劉傳春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北冠眾通科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/31;C12N15/81;C12P5/00;C12R1/865
• 代理公司: 武漢知產(chǎn)時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42238
• 代理人: 萬(wàn)文廣

1.一種高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、構(gòu)建釀酒酵母MVA途徑相關(guān)基因表達(dá)模塊：過(guò)表達(dá)tHMG1模塊，包括誘導(dǎo)型雙向強(qiáng)啟動(dòng)子pGAL1-10和MVA途徑限速酶編碼基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；

S2、構(gòu)建瓦倫烯生產(chǎn)相關(guān)基因表達(dá)模塊：ERG20-Linker-SmVS模塊，包括FPP合酶的編碼基因ERG20和瓦倫烯合成酶的編碼基因SmVS，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述SmVS的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

S3、構(gòu)建敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因表達(dá)的工程菌：將步驟S1所述釀酒酵母MVA途徑相關(guān)基因表達(dá)模塊和步驟S2所述瓦倫烯生產(chǎn)相關(guān)基因表達(dá)模塊整合至半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因位點(diǎn)，同時(shí)敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因表達(dá)模塊，將所述敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因表達(dá)模塊轉(zhuǎn)化至構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌GS-A3中，經(jīng)多次基因工程操作，獲得敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因表達(dá)的基因工程菌；

S4、構(gòu)建角鯊烯合酶途徑下調(diào)表達(dá)質(zhì)粒，包括將銅離子誘導(dǎo)啟動(dòng)子pCUP1替換為角鯊烯合酶基因ERG9啟動(dòng)子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鯊烯合酶基因ERG9啟動(dòng)子取至ERG9基因起始密碼子前450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；

S5、將步驟S5所述角鯊烯合酶途徑下調(diào)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至步驟S3所述的敲除半乳糖調(diào)節(jié)蛋白GAL80基因表達(dá)的基因工程菌中，依次經(jīng)抗生素抗性篩選，然后通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證，獲得高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌；

所述構(gòu)建方法還包括兩個(gè)終止子tCYC1和tERG20，所述終止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述終止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

2.如權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟S1中，所述過(guò)表達(dá)tHMG1模塊的構(gòu)建方法包括以下步驟：

S1、以釀酒酵母3000B基因組DNA為模板，分別用tCYC1-F和tCYC1-R、tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；

S2、將步驟S1獲得的三個(gè)DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通過(guò)用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，連接在一起，獲得過(guò)表達(dá)tHMG1模塊，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模塊。

3.如權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟S2中，所述ERG20-Linker-SmVS模塊的構(gòu)建方法包括以下步驟：

S1、以釀酒酵母3000B基因組DNA為模板，分別用ERG20-F和ERG20-Linker-W-R引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到DNA片段ERG20_Linker；

S2、用引物tERG20-W-F和tERG20-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到DNA片段tERG20；

S3、以質(zhì)粒pGZ221為模板，用引物L(fēng)inker-SmVS-F和SmVS-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到DNA片段Linker_SmVS；

S4、將步驟S1獲得的DNA片段ERG20_Linker、步驟S2獲得的DNA片段tERG20和步驟S3獲得的DNA片段Linker_SmVS，通過(guò)用引物ERG20-F和tERG20-R進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，連接在一起，獲得融合表達(dá)ERG20-Linker-SmVS模塊，即ERG20_Linker_SmVS_tERG20。

4.如權(quán)利要求3所述的一種高產(chǎn)瓦倫烯基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：Linker包括甘氨酸和絲氨酸，其組合結(jié)構(gòu)包括GSG、GGGS和GSGGSG中的任一種，其中G對(duì)應(yīng)核酸序列GGT，S對(duì)應(yīng)核酸序列TCT。