[發明專利]一種檢測高半胱氨酸的比率型熒光探針的制備方法及其在細胞成像與生物傳感中的應用

在審

• 申請號: 202111274856.4
• 申請日: 2021-10-29
• 公開（公告）號: CN113980037A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 張琪偉;田陽;韓玉界
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C07F5/02
• 分類號: C07F5/02;C09K11/06;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 夏思秋

1.一種Hcy熒光探針，其特征在于，其結構如下式DCB所示：

2.一種Hcy熒光探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

將無水N,N-二甲基甲酰胺DMF和三氯氧磷進行第一反應得到油狀物，然后加入有機溶劑和化合物1，在耐壓管中進行第二反應，得到Hcy熒光探針DCB，所述反應過程如下反應式(a)所示：

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反應的溫度為0℃-10℃；

和/或，所述第一反應的時間為10min-60min；

和/或，所述第二反應的溫度為50℃-100℃；

和/或，所述第二反應的時間為10h-12h；

和/或，所述三氯氧磷、DMF、化合物1的摩爾比為150-300：150-300：1；

和/或，所述有機溶劑選自二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。

4.如權利要求1所述的Hcy熒光探針在制備化合物2-4中的應用，其特征在于，具體制備步驟如下：

將如權利要求1所述的Hcy熒光探針DCB和3-巰基丙酸甲酯在乙腈中室溫反應得到化合物2，所述反應過程如下反應式所示：

或，將如權利要求1所述的Hcy熒光探針DCB和3-巰基丙酸甲酯在乙腈中室溫反應得到化合物3，所述反應過程如下反應式所示：

或，將如權利要求1所述的Hcy熒光探針DCB和正丁胺在乙腈溶劑中室溫反應得到化合物4，所述反應過程如下反應式所示：

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述化合物2的制備中，所述DCB和3-巰基丙酸甲酯的摩爾比為1：1-1.2；所述反應的時間為10-60min；所述溶劑選自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷；所述堿選自三乙胺、DABCO或哌啶；所述堿的加入量為底物DCB的1-5mol％；

和/或，所述化合物3的制備中，所述DCB和3-巰基丙酸甲酯的摩爾比為1：2-5；所述反應的時間為30-90min；所述溶劑選自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷；所述堿選自三乙胺、DABCO或哌啶；所述堿的加入量為底物DCB的1-5mol％；

和/或，所述化合物4的制備中，所述DCB和正丁胺的摩爾比為1：2-10；所述反應的時間為30-90min；所述溶劑選自乙腈，二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。

6.將如權利要求1所述的Hcy熒光探針用于在體外和/或細胞內檢測Hcy中的應用；其中，所述細胞不包括來源于人的細胞。

7.如權利要求1所述的Hcy熒光探針在細胞成像與生物傳感中的應用。

8.一種體外Hcy的熒光檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：在乙腈和緩沖液混合溶液中，將如權利要求1所述的Hcy熒光探針與Hcy進行反應，然后用激發波長為405nm的波長激發，測定溶液的熒光強度，隨著加入Hcy含量的增加，所述Hcy熒光探針本身的熒光強度逐漸降低，一個新的發射峰的熒光強度逐漸升高，呈比率型變化，有良好的線性，從而實現對Hcy的定量檢測。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；和/或，所述乙腈和緩沖液的體積比為1-10：90-100；和/或，所述反應的溫度為室溫；和/或，所述反應的時間為30s-10min。

10.一種在細胞內Hcy的熒光成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：將細胞與如權利要求1所述的Hcy探針共同孵育，之后加入緩沖液，然后利用共聚焦顯微鏡進行觀察，用激發波長為405nm的波長激發，觀察細胞在523nm發射熒光隨著Hcy的不斷增加，細胞中探針的523nm發射熒光逐漸降低，在548nm處的熒光逐漸增強，得到了一個比率響應，從而實現對細胞內Hcy的比率熒光響應并進行成像分析。