[發明專利]一種長雙歧桿菌及其篩選方法和二裂酵母發酵產物溶胞物的制備方法

在審

• 申請號: 202111266902.6
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN116042427A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 請求不公布姓名;邱媛媛;請求不公布姓名;趙仕蘭;薛虹宇;史魯秋;蘇桂珍
• 申請（專利權）人: 南京盛德生物科技研究院有限公司;南京華獅新材料有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K8/99;A61Q19/00;A61K35/745;A61P29/00;A61P17/00;C12R1/01
• 代理公司: 南京中擎科智知識產權代理事務所(普通合伙) 32549
• 代理人: 洪黎

1.一種長雙歧桿菌，其特征在于，所述長雙歧桿菌具有細胞修復、緩解炎癥作用，所述長雙歧桿菌為長雙歧桿菌Bifidobacterium?longum，株號Di4，于2021年8月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.23160。

2.一種篩選權利要求1所述的長雙歧桿菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

S1：樣品采集，將樣品經溶解和梯度稀釋后加入到滅菌的平板中；

S2：配置樣品培養基；

S3：將上述樣品培養基倒入所述平板中混合，厭氧培養，挑選平板上菌落長勢較好的菌株，進行基因序列比對，確定菌株類別，篩選出具有過氧化氫耐受性的長雙歧桿菌；

S4：將驗證為長雙歧桿菌的菌株在MRS固體培養基上劃線，挑單克隆，進行基因序列比對，確保是長雙歧桿菌后再重復以上劃線步驟，直至得到無雜菌的單一長雙歧桿菌。

S5：將上述得到的單一長雙歧桿菌接到MRS液體培養基中，有氧培養，挑選其中長勢最好的長雙歧桿菌，備用。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S1中所述樣品采集自健康嬰兒糞便。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S2中所述樣品培養基按照如下方法制備：向50-50℃的MRS培養基加入過氧化氫溶液，使培養基中起始的過氧化氫濃度為0.5mmol/L，即得到樣品培養基。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS培養基為：蛋白胨0.8-2％，牛肉膏0.5-2％，酵母膏0.25-0.8％，葡萄糖1.5-3％，檸檬酸胺0.1-0.3％，乙酸鈉0.25-0.75％，吐溫80?0.1％和瓊脂2％，調節pH為6.3-6.8，加蒸餾水至1000mL，115℃滅菌20min制得。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S3中所述厭氧培養條件為：溫度22-40℃，時間16-48h。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S5中所述有氧培養條件為：溫度22-40℃，時間16-48h。

8.一種根據權利要求1所述的長雙歧桿菌制備二裂酵母發酵產物溶胞物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)將長雙歧桿菌接種到MRS固體培養基上，22-40℃下進行活化培養16-48h，得到活化的長雙歧桿菌，將活化的長雙歧桿菌接種到MRS液體培養基中，22-40℃下有氧培養16-48h，得到長雙歧桿菌液，作為種子；

(2)將長雙歧桿菌菌液接種于發酵液中進行發酵，得到長雙歧桿菌發酵液；

(3)將發酵好的長雙歧桿菌離心收集菌體，將菌體清洗后重懸，然后處理后滅菌，即制得二裂酵母發酵產物溶胞物。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述發酵液配方為：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，檸檬酸胺0.2％，乙酸鈉0.5％，吐溫80?0.1％，在發酵過程中用NaOH調節pH至6.8。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述發酵條件為：溫度25～37℃，時間20～50h；步驟(3)中采用生理鹽水或者PBS清洗菌體，采用高壓均質或加溶酶菌進行處理。