[發明專利]一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備及應用

在審

• 申請號: 202111261808.1
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113817764A
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 陳瑞愛;蘭虹;熊挺;何獻銘;楊澤坤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/34;C07K14/075;C12N1/21;C07K1/22;A61K39/235;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

1.一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下制備步驟：

(1)以FAdV-4毒株DNA為模板，fiber2-F和fiber2-R為引物，PCR擴增出fiber2序列；

fiber2-F：5’-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3’；

fiber2-R：5’-GCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA-3’；

所述fiber2序列為SEQ ID NO：3；

(2)將步驟(1)擴增出的fiber2序列N段插入BamHⅠ酶切位點，在C端終止密碼子之前插入6×His標簽以及HindⅢ酶切位點，然后進行密碼子優化并合成序列，得到經過密碼子優化的fiber2序列；所述經過密碼子優化的fiber2序列為SEQ ID NO：4；

(3)將步驟(2)經過密碼子優化的fiber2序列構建到pMal-c2X載體上，得到重組質粒pMal-c2X-FAV4-fiber2；

(4)將步驟(3)所得重組質粒pMal-c2X-FAV4-fiber2轉化大腸桿菌BL21進行誘導表達，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述PCR擴增體系如下：

PCR反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸54s，共34個循環；72℃延伸10min。

3.根據權利要求1所述的一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述將經過密碼子優化的fiber2序列構建到pMal-c2X載體上的步驟為：

將經過密碼子優化的fiber2片段與空載體pMal-c2X用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內切酶進行雙酶切，酶切結束后，進行1％核酸凝膠電泳純化，將目的條帶切膠后進行膠回收，得到回收的目的片段fiber2和回收的空載體，然后將回收的目的片段fiber2和回收的空載體在T4連接酶條件下進行連接反應，得到重組質粒pMal-c2X-FAV4-fiber2。

4.根據權利要求3所述的一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備方法，其特征在于，所述雙酶切的反應時間為4h，反應溫度為37℃，反應體系如下：

所述連接反應的反應時間為12h，反應溫度為16℃，反應體系如下：

5.根據權利要求1所述的一種I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述轉化大腸桿菌BL21的步驟為：

1)取重組質粒pMal-c2X-FAV4-fiber2加入E.coli BL21感受態細胞中，冰浴30min；

2)42℃熱激90s；冰浴2min；

3)在超凈臺內加入900μL SOC培養基，置于37℃搖床中220rpm搖1h；

4)取菌液涂布在氨芐抗性LB平板上，37℃過夜培養，挑取單克隆加入氨芐抗性LB培養基中搖至OD值為0.8后，菌液和50％甘油1:1混合均勻得到甘油菌懸液，后于-80℃保存備用。