[發(fā)明專利]一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜及其檢測方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111259337.0
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113960232A
• 公開（公告）日: 2022-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊霜;蔣軍紅;高子媛
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;G01N30/06;C12P19/18;C12P19/28
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

1.一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜，其特征在于，包括如下通式結(jié)構(gòu)：

其中，

F為巖藻糖；

G為半乳糖；

M為甘露糖；

N為乙酰氨基葡糖；

α1,2代表G單糖的碳2與F單糖的碳1連接；

α1,3代表N單糖的碳3與F單糖的碳1連接；

α1,6代表N單糖的碳6與F單糖的碳1連接。

2.一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于，包括步驟：

1)從蛋白質(zhì)中提取聚糖；

2)確定聚糖巖藻糖鏈接的方法；

3)唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于：步驟1)中，所述從蛋白質(zhì)中提取聚糖包括：

(1)填充移液管制備：

將微米級多孔篩板加入空心移液管；

將表面修飾有醛基的納米級多孔微米球形樹脂填充到空心移液管，填充后空心移液管稱為填充移液管；

將另一個微米級多孔篩板加入至所述填充移液管中，將醛基樹脂固定于所述填充移液管中；

(2)蛋白固相結(jié)合

將蛋白質(zhì)溶于去離子水中，用塑料離心管存放溶解后的蛋白質(zhì)；

將所述溶解后的蛋白質(zhì)加熱變性，冷卻至室溫后加入二硫蘇糖醇還原，最后加入碘乙酰胺將蛋白質(zhì)烷基化，獲得樣本；

通過洗脫和離心將反應(yīng)緩沖液替換為PBS，同時加入氰硼氫化鈉室溫反應(yīng)，將蛋白與固相形成的-C＝N-還原成-C-N-共價鍵；

將所述填充移液管上的樣本清洗；

(3)N-聚糖制備

在所述填充移液管中加入N-糖苷酶，使用碳酸氫銨緩沖溶液，將N-聚糖從所述填充移液管樹脂上固定的蛋白質(zhì)酶解至碳酸氫銨緩沖溶液中；

通過離心收集上清液，再加入稀釋乙腈洗脫填充移液管樹脂，并收集上清液，重復(fù)此步驟一次；

將所有收集的上清液合并，取其中部分用質(zhì)譜儀器分析聚糖成分和豐度。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于，在步驟(2)中所述通過洗脫和離心將反應(yīng)緩沖液替換為PBS，同時加入氰硼氫化鈉室溫反應(yīng)，將蛋白與固相形成的-C＝N-還原成-C-N-共價鍵之前還包括：調(diào)節(jié)樣本pH值至10，加入檸檬酸鈉和醋酸鈉配制的緩沖液，反應(yīng)使蛋白質(zhì)N-端和/或賴氨酸與固相樹脂上的醛基反應(yīng)結(jié)合；再加入氰硼氫化鈉到所述樣本中反應(yīng)，將-C＝N-還原形成-C-N-共價鍵。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于，在步驟(3)之前還包括確定α1,2巖藻糖、α1,3巖藻糖和α1,6巖藻糖中的任意一種或多種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于，所述確定α1,2巖藻糖包括：加入α1-2巖藻糖苷酶到所述填充移液管樹脂固相中，將α1,2巖藻糖酶解；通過所述酶解反應(yīng)，將α1,2巖藻糖從聚糖上酶切，所得聚糖分子量如果相差一個巖藻糖，則推斷含有一個α1,2巖藻糖，如果相差兩個巖藻糖分子量，則推斷含有兩個α1,2巖藻糖，以此類推；如果α1-2巖藻糖苷酶酶切后聚糖仍含有巖藻糖，則推斷該聚糖可含有α1,3巖藻糖和/或核心α1,6巖藻糖。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于唾液特異性巖藻糖基化結(jié)構(gòu)糖譜的檢測方法，其特征在于，所述確定α1,3巖藻糖包括：在所述填充移液管樹脂固相中加入α1-2,3,4巖藻糖苷酶，將α1,3巖藻糖酶解；通過所述酶解反應(yīng)將α1,3巖藻糖從聚糖上酶切，所得聚糖分子量如果相差一個巖藻糖，則推斷含有一個α1,3巖藻糖，如果相差兩個巖藻糖分子量，則推斷含有兩個α1,3巖藻糖，以此類推；如果α1-2,3,4巖藻糖苷酶酶切后聚糖仍含有巖藻糖，則推斷該聚糖可能為核心α1,6巖藻糖。