[發明專利]一種γ-生育酚甲基轉移酶突變體及其在提高α-生育酚及α-生育三烯酚產量的應用

有效

• 申請號: 202111257133.3
• 申請日: 2021-10-27
• 公開（公告）號: CN113817705B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 孟永宏;茍元元;郭建琦;牛永潔;楊璐
• 申請（專利權）人: 陜西海斯夫生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P17/06;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

本發明提供一種γ?生育酚甲基轉移酶突變體D81M，所述突變體是對來源于擬南芥的γ?生育酚甲基轉移酶氨基酸序列進行突變，將第81位天冬氨酸突變為蛋氨酸得到的。本發明還提供上述γ?生育酚甲基轉移酶突變體D81M在制備α?生育酚或α?生育三烯酚中的應用。本發明的突變體D81M顯著提高了γ型生育酚和生育三烯酚向α型轉化的效率，提高了α型生育酚和生育三烯酚的含量，其α?生育酚的產量可達到193.2mg/L，轉化率為72.6％，α?生育三烯酚的產量為210.8mg/L，轉化率為79.2％，顯著優于現有技術。

【技術領域】

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種γ-生育酚甲基轉移酶突變體，還涉及含有所述突變體的工程菌株，及其在提高α-生育酚及α-生育三烯酚產量的應用。

【背景技術】

維生素E是生育酚和生育三烯酚的總稱，它是一種兩親性分子，由莽草酸途徑來源的極性芳香族頭部和親脂性類異戊二烯側鏈組成。根據側鏈的飽和度和芳香環上甲基數目和位置的不同，分為α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚這8種化合物，其中α-生育酚更易被機體吸收，因此，α-生育酚被認為是最具活性的物質。生育酚是重要的抗氧化劑，具有清除自由基，終止脂質鏈式氧化反應的作用，且對心血管疾病、癌癥等有積極作用，還可以提高免疫力、抗衰老和促進生育功能。

γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT)是生育酚合成途徑最后階段的關鍵酶，催化γ-和δ-生育酚(生育三烯酚)轉化為α-和β-生育酚(生育三烯酚)?？梢哉fγ-TMT基因就控制著著α-生育酚含量的高低。研究顯示γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT)在進化的過程中高度保守，在擬南芥和集胞藻中幾乎具有相同的活性。擬南芥γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT)可以改變種子中維生素E的組分，過量表達使種子中的γ-生育酚大量轉化為α-生育酚。但是γ-TMT的活性有限，不足以催化γ-生育酚大量轉化為α-生育酚。于是相當多的研究人員對γ-生育酚甲基轉移酶進行了過量表達。Shintani和DellaPenna在擬南芥中過量表達γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT)使α-生育酚的含量提高了80倍(Shintani et al.,1998)。在水稻，紫蘇，大豆中分別過量表達γ-生育酚甲基轉移酶(γ-TMT),α-生育酚的含量都得到了顯著提高(Cho et al.,2005,Tavva et al.,2007,Yusuf et al.,2007)。

隨著目前維生素E強大功能的普及和對維生素E的不斷深入研究，市場需求也在不斷增加，促使天然維生素E的生產方法不斷改進。目前的化學合成方法主要存在收率低、純度不高、浪費較大、易污染環境、設備昂貴、操作復雜及質量差等問題。而通過對關鍵酶基因的克隆和調控基因高效表達等生物工程技術手段仍然存在產量低的問題。通過酶催化反應合成生產生育酚具有促進其生產和工業應用的潛力。

【發明內容】

在生育酚和生育三烯酚的生產中，γ-生育酚甲基轉移酶是γ-生育酚和γ-生育三烯酚向α-生育酚和α-生育三烯酚轉化的關鍵基因，在目前的研究中，α類型活性是最高的，但是α類型所占比例不高，存在α型生育酚和生育三烯酚轉化率低導致的α-生育酚和生育三烯酚產量低的問題。

本發明的思路是通過基因序列定點突變，對來自擬南芥的γ-生育酚甲基轉移酶進行分子改造。

基于此，本發明提供一種γ-生育酚甲基轉移酶突變體D81M，所述突變體是對來源于擬南芥的γ-生育酚甲基轉移酶氨基酸序列進行突變，將第81位天冬氨酸突變為蛋氨酸得到的。

在本發明中，所述突變體D81M的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

進一步地，本發明還提供編碼上述γ-生育酚甲基轉移酶突變體的基因，以及攜帶上述基因的載體，和表達上述基因或上述載體的基因工程菌。

特別地，對于所述基因工程菌，其宿主菌為大腸桿菌，以pET-28a為載體。

進一步地，本發明還提供上述的γ-生育酚甲基轉移酶突變體D81M在制備α-生育酚或α-生育三烯酚中的應用。