[發明專利]一種人外周血單個核細胞膜表面轉運體的檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202111255448.4
• 申請日: 2021-10-27
• 公開（公告）號: CN114002347B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 秦偉;劉麗宏;李朋梅;王曉雪;陳文倩;張相林
• 申請（專利權）人: 中日友好醫院（中日友好臨床醫學研究所）
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京頭頭知識產權代理有限公司 11729
• 代理人: 白芳仿;劉鋒

本發明涉及細胞膜蛋白質檢測技術領域，特別是涉及一種人外周血單個核細胞膜表面轉運體的檢測方法及應用，該方法包括以下步驟：(1)分離人外周血單個核細胞；(2)提取外周血單個核細胞膜蛋白；(3)膜蛋白前處理；(4)納升液相串聯高分辨質譜檢測，計算PBMC膜表面轉運體表達量。本發明方法不僅可用于器官移植患者PBMC膜表面轉運體的檢測，也可以應用于其它免疫疾病患者PBMC膜表面轉運體的檢測；僅需約1?3mL的全血樣品就能夠檢測PBMC膜表面轉運體，能夠同時檢測多種轉運體，通量較高。

技術領域

本發明涉及細胞膜蛋白質檢測技術領域，特別是涉及一種檢測人外周血單個核細胞膜表面轉運體的檢測方法及應用。

背景技術

器官移植術后需要使用免疫抑制劑預防器官排異反應的發生，用于器官移植的免疫抑制劑主要包括糖皮質激素、鈣調酶抑制劑、抗增殖和抗代謝類抑制劑以及抗體類生物制劑。免疫抑制劑通過進入淋巴細胞，與淋巴細胞中的他克莫司結合蛋白(FKBP12)、mTOR等蛋白結合發揮藥理作用，形成的TAC-FKBP12、Sirolimus-FKBP-mTOR等復合物抑制參與T-細胞激活的鈣調磷酸酶，抑制T-細胞激活從而發揮免疫抑制作用。淋巴細胞中免疫抑制劑的濃度才能夠真正反映其發揮藥效的濃度。

免疫抑制劑在體內代謝過程中通過轉運體轉運進出細胞，外排型轉運體(ABCs)、攝取型轉運體(SLCs)均會參與免疫抑制劑的轉運過程。已有研究報道他克莫司是ABCB1、ABCA5的底物，環孢素、依維莫司、甲強龍是ABCB1的底物，霉酚酸酯是ABCB1、ABCC2、ABCG2、SLCO1B1、SLCO1B3的底物，硫唑嘌呤是ABCB1、SLC29A2、SLC28A3、SLC43A3的底物，來氟米特是ABCG2的底物。ABCB1、ABCC2、ABCC8、SLC30A8、SLCO1B1/3、SLC28A1、SLC22A11、SLC28A3等轉運體的基因多態性與他克莫司代謝的差異性及毒性反應的發生也相關。

淋巴細胞膜表面也存在藥物轉運體，不同轉運體的基因多態性和轉運體蛋白表達量影響轉運體轉運免疫抑制劑的能力。每個個體的基因多態性是保持不變的，而轉運體蛋白表達量會隨著生理、病理及藥物暴露量的變化而發生改變。因此，監測淋巴細胞膜表面的轉運體表達量將有助于臨床設計免疫抑制劑用藥劑量，為免疫抑制劑的個體化精準用藥提供幫助。外周血單個核細胞(PBMC)的主要組成是淋巴細胞，常用于淋巴細胞的相關研究，可以通過監測PBMC膜表面的轉運體蛋白表達量反應淋巴細胞膜表面轉運體的表達情況。

傳統檢測膜蛋白的方法有ELISA、Western?Blotting、流式細胞術等技術，傳統方法均基于抗原抗體結合原理進行檢測，容易受到基質中相似成分的干擾。

發明內容

本發明目的在于提供一種人外周血單個核細胞膜表面轉運體的檢測方法及應用。本方法采用納升液相串聯高分辨質譜檢測技術，相比傳統檢測方法，本方法選擇性和通量均較高，不易受到基質中相似蛋白質的干擾，并且能夠同時檢測多種轉運體的蛋白表達情況。

具體而言，本申請提供了如下技術方案：

一種人外周血單個核細胞膜表面轉運體的檢測方法，包括以下步驟：

(1)分離人外周血單個核細胞(PBMC)

1.1)取PBMC分離液Ficoll?1.077試劑于離心管中，緩慢加入健康人全血，緩慢放入離心機離心獲得離心產物后，吸取中間白膜層細胞轉移至新的離心管中，加入PBMC清洗液輕柔混勻；

1.2)再放入離心機中離心獲得離心產物，加入PBMC清洗液輕柔混勻；

1.3)再放入離心機中離心獲得離心產物，加入紅細胞裂解液，室溫靜置，裂解未完全分離的紅細胞，轉移至新離心管中；

1.4)放入離心機中離心獲得離心產物后，再加入PBMC清洗液輕柔混勻，放入離心機中離心獲得離心產物；