[發明專利]脫氮副球菌銨鹽誘導型啟動子

有效

• 申請號: 202111255374.4
• 申請日: 2021-10-27
• 公開（公告）號: CN113881675B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 周勝虎;鄧禹;牛曉倩;趙運英;毛銀;李國輝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了脫氮副球菌銨鹽誘導型啟動子，屬于合成生物學領域。本發明脫氮副球菌基因組中篩選出15個受銨鹽誘導的可調控不同表達強度的啟動子Psubgt;1849/subgt;、Psubgt;rpsu/subgt;、Psubgt;2495/subgt;、Psubgt;mdh/subgt;、Psubgt;1851/subgt;、Psubgt;2068/subgt;、Psubgt;4130/subgt;、Psubgt;2486/subgt;、Psubgt;2480/subgt;、Psubgt;1869/subgt;、Psubgt;cs/subgt;、Psubgt;rpst/subgt;、Psubgt;4462/subgt;、Psubgt;nir/subgt;和Psubgt;1690/subgt;，將上述啟動子用于脫氮副球菌中調控熒光蛋白的表達，在銨鹽存在的情況下單位OD的熒光響應值是無銨鹽時的9～32倍，可作為基因表達調控元件，用于精細調控基因表達、精細調控代謝通路，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及脫氮副球菌銨鹽誘導型啟動子，屬于合成生物學領域。

背景技術

近幾十年來人們逐漸重視環境保護，國家加大力度對污染水體進行防治，但多年來河流、湖泊等污染未能得到有效地遏制，水體污染負荷不斷增加，富營養化問題仍然嚴重，飲用水安全依然受到威脅。由于氮污染物來源廣泛、污染途徑及過程復雜、傳統的脫氮技術處理效果不高、新的脫氮技術難以實現規模化應用等原因，由此可見氮污染是難以控制，而且解決氮污染也是相當困難的。生物脫氮是目前污水脫氮處理中最常用也是最有效的方法，而選取具有脫氮功能的菌株是生物脫氮的基礎。

為了降解復雜污水環境中的氮素，獲得高效的氮素降解微生物也是至關重要的，這將可能從根本上解決目前脫氮工程中面臨的困難。隨著對脫氮微生物的深入了解，研究人員發現有些脫氮菌中存在異養硝化和好氧反硝化的偶聯過程，此類菌被稱為異養硝化-好氧反硝化菌(heterotrophic?nitrifying?and?aerobic?denitrifying?bacteria,HN-AD)。HN-AD菌的發現為單級脫氮工藝提供了基礎，突破了硝化菌與反硝化菌共培養脫氮的傳統脫氮工藝。脫氮副球菌(Paracoccus?denitrificans)具有硝化與好氧反硝化一體的功能，因此成為脫氮的模式菌種。P.denitrificans是一種革蘭氏陰性菌，形態為球狀，既能生活在好氧條件下，也能在厭氧的環境中生存，適應性較強。目前已有研究提出脫氮副球菌不僅能夠進行好氧反硝化作用，還能夠將氨氮轉化為亞硝態氮，具有異養硝化功能。P.denitrificans除了具有脫氮的功能外，還對有機污染物具有很高的降解能力，可應用于含有氰化物、吡啶、苯等多種有機污染物的污水生物處理以及被污染土壤的生物修復。因此，P.denitrificans在新型廢水生物脫氮中具有一定的研究價值和應用潛力。

脫氮副球菌基因工程，是改良P.denitrificans降解氨氮的一種手段。然而，在P.denitrificans中缺少高效的遺傳轉化系統，大大限制了基因工程在P.denitrificans中降解氨氮的應用。因此，很有必要建立一套高效的遺傳轉化系統。其中載體是遺傳轉化體系的核心部分，而啟動子是載體能否高效表達的關鍵元件。因此，針對P.denitrificans在生物氮循環中的重要作用，開展P.denitrificans銨鹽誘導型基因元件啟動子的挖掘和功能性研究，有助于建立適用于P.denitrificans高效率的遺傳轉化系統，提高P.denitrificans降解氨氮的效率。

發明內容

本發明提供了銨鹽誘導型啟動子，具有如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.15任一所示的核苷酸序列，能夠啟動在脫氮副球菌中的基因轉錄。

本發明還提供了含銨鹽誘導型啟動子的重組表達載體，所述重組表達載體能夠允許插入目的基因并使目的基因在細菌中表達出蛋白。

在一種實施方式中，所述載體包括但不限于PIND₄。