[發(fā)明專利]一種與豬有腔卵泡閉鎖相關(guān)的miRNA分子及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111253348.8
• 申請日: 2021-10-27
• 公開（公告）號: CN113817845A
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張金璧;徐世永;茅慧華;劉京鴿;陳清
• 申請（專利權(quán)）人: 金陵科技學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

本發(fā)明屬于家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬有腔卵泡閉鎖相關(guān)的microRNA(miRNA)及其應(yīng)用；所述miRNA為miR?9820?5p，其線性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本發(fā)明針對miR?9820?5p設(shè)計特異性雜交探針，經(jīng)熒光原位雜交驗證所述的miR?9820?5p的真實存在；針對miR?9820?5p設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)熒光定量PCR檢測到miR?9820?5p在豬卵巢中健康有腔卵泡組織中表達(dá)低于閉鎖卵泡，用相應(yīng)類似物和抑制物處理證實miR?9820?5p對顆粒細(xì)胞凋亡具有顯著促進(jìn)作用；同時，本發(fā)明設(shè)計分別提供miR?9820?5類似物和抑制物的核苷酸序列；本發(fā)明公開的miR?9820?5p有望作為母豬繁殖相關(guān)的分子標(biāo)志物，為豬繁殖性狀的評價，繁殖力提升，為人類卵泡異常相關(guān)疾病的發(fā)生和預(yù)防提供新的理論基礎(chǔ)和潛在的分子標(biāo)靶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬有腔卵泡閉鎖相關(guān)的miRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

雌性動物的生殖性能，尤其是產(chǎn)仔數(shù)與其排卵數(shù)量緊密相關(guān)。卵泡閉鎖是哺乳動物卵泡發(fā)育過程中的一種自然生理現(xiàn)象。在母豬出生前后，其原始卵泡腔形成，其卵泡儲備含有大約500萬個原始卵泡。然而在生長發(fā)育及發(fā)情周期過程中，大量卵泡在直徑達(dá)到6毫米之前發(fā)生閉鎖和消失，導(dǎo)致最終可實現(xiàn)的排卵率低于14％。作為卵泡的主要組成部分，顆粒細(xì)胞通過與卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞密切相互作用并產(chǎn)生旁分泌物質(zhì)而發(fā)揮功能。研究表明，顆粒細(xì)胞增殖和功能在卵泡發(fā)育和成熟中至關(guān)重要，而顆粒細(xì)胞凋亡率隨著卵泡閉鎖的進(jìn)展而顯著增加，因此顆粒細(xì)胞凋亡水平是卵泡閉鎖的主要標(biāo)志之一。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，一般通過轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄后降解廣泛參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)有15-30％的動物基因組由miRNA直接調(diào)控，人類中1/3的基因都受到miRNA的調(diào)控。miRNA分布廣泛，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡、增殖等生物過程。2007年，miRNA在卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟的調(diào)控的參與在Dicer酶基因敲除的小鼠模型中首次得到證實。2010年，miR-21成為第一個被證實在哺乳動物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的miRNA，近年來發(fā)現(xiàn)miRNA在卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞中均發(fā)揮的重要調(diào)控作用，提示了miRNA在卵泡閉鎖過程中的調(diào)控作用和應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種與母豬繁殖相關(guān)的miRNA，所述的miRNA為豬miR-9820-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中miR-9820-5p表達(dá)水平的試劑，所述miR-9820-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述試劑含有特異性擴(kuò)增miR-9820-5p的反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物及可用于熒光定量PCR檢測的上游引物，或特異性標(biāo)記miR-9820-5p的熒光原位雜交探針；所述特異性反轉(zhuǎn)錄miR-9820-5p的莖環(huán)引物的序列如SEQ ID NO:2所示；

本發(fā)明提供了一種特異性擴(kuò)增miR-9820-5p，并可用于熒光定量PCR檢測的上游引物，該上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，配合miRNA擴(kuò)增通用下游引物使用，該通用下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示；提供一種特異性標(biāo)記miR-9820-5p的原位雜交探針，該探針的序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明提供了一種miR-9820-5p的特異性mimics雙鏈序列，該mimics序列如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

本發(fā)明提供了一種miR-9820-5p的特異性inhibitor序列，該inhibitor序列如SEQID NO:7所示。

本發(fā)明提供的miRNA在動物細(xì)胞和組織表達(dá)量檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的miRNA在母豬的選擇評定、配種、遺傳改良以及卵巢病理檢測中的應(yīng)用。