[發明專利]基于互補探針技術快速檢測MTHFR基因多態性的引物組、試劑盒、方法及應用

在審

• 申請號: 202111249441.1
• 申請日: 2021-10-26
• 公開（公告）號: CN113930488A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 劉金輝;方亞妮
• 申請（專利權）人: 陜西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 汪海艷

本發明提供了一種基于互補探針技術快速檢測MTHFR基因多態性的引物組、試劑盒、方法及應用，適用于體外快速檢測MTHFR基因c.677CT多態性。方法包括以下步驟：(1)互補探針、熒光標記引物和通用下游引物的設計及合成；(2)獲取待測樣本的基因組DNA；(3)配制反應體系；(4)進行PCR反應；(5)基因型判定。本發明實現了在不需要雙標熒光探針的前提下，僅一個反應即完成MTHFR基因c.677CT多態性檢測的目的。

技術領域

本發明涉及一種檢測MTHFR基因多態性的方法，具體涉及一種基于互補探針技術快速檢測MTHFR基因多態性的引物組、試劑盒、方法及應用。

背景技術

人亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因編碼的蛋白在5，10-亞甲基四氫葉酸還原成5-甲基四氫葉酸的過程起關鍵催化作用。MTHFR基因存在廣泛的基因多態性，c.677CT是該基因在中國人群中最常見的單核苷酸多態性。c.677CT多態性會導致MTHFR酶活性的改變，通過對MTHFR基因的c.677CT多態性位點進行基因分型，可實現該酶活性的等效快速檢測。

傳統的單核苷酸多態性檢測方法多為實驗室常用技術，如DNA測序、限制性片段長度多態性及核酸雜交芯片等。盡管展現出很高的準確性，但缺陷依舊明顯：其一，測序和芯片平臺價格昂貴且操作程序復雜，需配備專業實驗操作和分析人員，不適宜在基層醫院或醫學檢驗所開展；其二，屬于“開管”檢測，依賴于凝膠電泳平臺，易產生假陽性的結果；其三，耗時較長，自取樣到最終遞呈檢測報告，往往需要等待超過24小時，不適宜作為伴隨檢測技術；其四，不適合無創取樣檢測，如咽試紙取樣僅能獲得微量的DNA，多數情況下不能滿足此類技術的“門檻”。

商品化的試劑盒多采用熒光定量-ARMS的方法檢測MTHFR基因的c.677CT多態性。該技術操作簡便，靈敏度高，但仍有明顯的不足之處。其一，雙標熒光探針合成難度大、成本高；其二，部分的熒光定量-ARMS技術使用傳統的Taqman雙標熒光探針，需要同時設置兩個反應才能完成該多態性位點的檢測，其檢測通量受到限制；其三，使用MGB熒光探針可實現該多態性的單反應檢測，但該類探針的合成原料受專利限制，成本高且獲取難度大。此外，使用MGB熒光探針進行多態性檢測通常無法克服信噪比低的缺陷。

發明內容

為了克服傳統檢測方法的不足之處，本發明提出一種基于互補探針技術快速檢測MTHFR基因多態性的引物組、試劑盒及方法，不僅大幅度降低了試劑成本，同時具有高通量和高特異性的特點，檢測結果十分可靠。

為實現以上發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于互補探針技術快速檢測MTHFR基因多態性的引物組，其特殊之處在于：針對MTHFR基因的c.677CT多態性位點設計，包括以下核苷酸序列的引物和探針：

通用下游引物：5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’；

C熒光標記引物：

5’-熒光基團1-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA為互補探針結合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC為基礎引物序列；

T熒光標記引物：

5’-熒光基團2-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT-3’

其中AGTGCTATCCGAGGGAA為互補探針結合序列；

AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT為基礎引物序列；