[發明專利]高產生育三烯酚的重組工程菌株、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 202111245253.1
• 申請日: 2021-10-26
• 公開（公告）號: CN113930350A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 孟永宏;王歡;茍元元;郭建琦;牛永潔;楊璐
• 申請（專利權）人: 西安海斯夫生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/02;C12N9/10;C12N9/90;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/66;C12P17/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

1.高產生育三烯酚的重組解脂亞羅酵母，其特征在于所述重組解脂亞羅酵母含有重組質粒a和重組質粒b，其中，所述重組質粒a含有經密碼子優化的生育三烯酚合成上游基因，所述經密碼子優化的生育三烯酚合成上游基因編碼的蛋白質包括對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶和尿黑酸植基轉移酶；所述重組質粒b含有經密碼子優化的生育三烯酚合成下游基因，所述經密碼子優化的生育三烯酚合成下游基因編碼的蛋白質包括2-甲基-6-香葉基香葉基苯醌甲基轉移酶、生育酚環化酶和γ-生育酚甲基轉移酶。

2.根據權利要求1所述的重組解脂亞羅酵母，其特征在于所述對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶來源于薺菜、蘿卜、白菜、山崳菜和油菜。

3.根據權利要求1所述的重組解脂亞羅酵母，其特征在于所述尿黑酸植基轉移酶來源于檸檬草、八爪草、發菜、小球藻和藍藻。

4.根據權利要求1所述的重組解脂亞羅酵母，其特征在于所述2-甲基-6-香葉基香葉基苯醌甲基轉移酶、生育酚環化酶和γ-生育酚甲基轉移酶來源于擬南芥。

5.根據權利要求1所述的重組解脂亞羅酵母，其特征在于所述對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶基因來源于油菜，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，所述尿黑酸植基轉移酶基因來源于小球藻，其堿基序列如SEQ ID No.2所示。

6.根據權利要求1所述的重組解脂亞羅酵母，其特征在于通過SD-ura培養基獲得去除ura3標記的重組解脂亞羅酵母。

7.權利要求2-4中任一項權利要求所述的重組解脂亞羅酵母的構建方法，所述方法包括以下步驟：

(1)構建含有對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶基因的重組工程菌株

獲取并合成來源于薺菜(CdHPPD)、蘿卜(RsHPPD)、白菜(BrpHPPD)、山崳菜(EsHPPD)和油菜(BrHPPD)的對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)基因序列，分別以NdeⅠ/SpeⅠ為酶切位點雙酶切載體ploxpura3loxp和基因HPPD并連接獲得重組質粒ploxpura3loxp-CdHPPD、ploxpura3loxp-RsHPPD、ploxpura3loxp-BrpHPPD、ploxpura3loxp-EsHPPD和ploxpura3loxp-BrHPPD，將以上重組質粒用限制性酶SmaI酶切線性化，采用酵母轉化試劑盒方法轉入解脂亞羅酵母工程菌中，所得重組工程菌株經PCR方式驗證正確；

(2)構建含尿黑酸植基轉移酶基因的重組工程菌株

獲取并合成來源于檸檬草(LiHPT)、八爪草(AhHPT)、發菜(NopHPT)、小球藻(GaHPT)和藍藻(HcHPT)的HPT基因序列，分別以NdeⅠ/SpeⅠ為酶切位點雙酶切載體ploxpura3loxp和基因HPT并連接獲得重組質粒ploxpura3loxp-LiHPT、ploxpura3loxp-AhHPT、ploxpura3loxp-NopHPT、ploxpura3loxp-GaHPT和ploxpura3loxp-HcHPT，將構以上重組質粒用限制性酶SmaI酶切線性化，采用酵母轉化試劑盒方法轉入步驟(1)的重組工程菌株中，所得重組工程菌株經PCR方式驗證正確；

(3)構建含有2-甲基-6-香葉基香葉基苯醌甲基轉移酶、生育酚環化酶和γ-生育酚甲基轉移酶基因的重組工程菌株

獲取并合成源于擬南芥的2-甲基-6-香葉基香葉基苯醌甲基轉移酶、生育酚環化酶和γ-生育酚甲基轉移酶基因序列，分別以NdeⅠ/SpeⅠ為酶切位點雙酶切載體ploxpura3loxp和基因HPT并連接獲得重組質粒ploxpura3loxp-MPBQMT、ploxpura3loxp-TC和ploxpura3loxp-γ-TMT，將以上重組質粒用限制性酶SmaI酶切線性化，采用酵母轉化試劑盒方法分別轉入步驟(2)的重組菌株中，所得菌株經PCR驗證正確后得到高產生育三烯酚的重組解脂亞羅酵母。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于將所得重組解脂亞羅酵母在SD-LEU培養基上培養，所得的單菌落為去除ura3標記的重組解脂亞羅酵母。

9.權利要求1-6中任一項權利要求所述的重組解脂亞羅酵母在生產生育三烯酚中的應用。