[發明專利]一種排除樣本異質性及高豐度干擾能力的質控方法

在審

• 申請號: 202111243948.6
• 申請日: 2021-10-26
• 公開（公告）號: CN113687002A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 李捷;陳亮宇;吳小雷;宋雷
• 申請（專利權）人: 譜天（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N33/68;G01N15/10
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種排除樣本異質性及高豐度干擾能力的質控方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）培養多種細胞系，收集細胞；

（2）在保證細胞總量一致情況下，對上述不同的細胞進行一系列不同比例的混合，制成混合細胞樣品組用以模擬樣本異質性或高豐度干擾；

（3）將上述混合細胞樣品制成質控標準品；

（4）對上述質控標準品進行蛋白分析實驗，獲取數據；

（5）對數據中各種細胞所擁有的獨立特征蛋白進行定量，并對比各特征蛋白定量數據是否與上述混檢的細胞數量比例相一致及偏差程度，即用于評價該蛋白組學分析方法對抗樣本異質性干擾的能力；分析各特征蛋白定量數據在存在或不存在高豐度蛋白干擾時的一致性及偏差程度，即用于評價該蛋白質組學分析方法對抗高豐度蛋白干擾的能力。

2.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（1）中，所述細胞系含有人源細胞系，包括正常細胞和癌細胞；所述人源細胞系的細胞種類包括組織細胞、間質細胞、免疫細胞或紅細胞。

3.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（1）中，所述細胞系選自：來自肺組織的正常成纖維細胞和帶有EGFR突變的肺部腺癌細胞，或者帶有EGFR突變的肺部腺癌細胞和正常紅細胞，或者來自肺組織的正常成纖維細胞、帶有EGFR突變的肺部腺癌細胞和正常紅細胞。

4.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（1）中，排除樣本異質性時，使用多種具有獨立蛋白表達特征的同組織來源細胞系；排除高豐度干擾能力時，使用組織細胞與含有特定高豐度蛋白的細胞。

5.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（2）中，至少混合兩種細胞，不同細胞沉淀混合總和一致，包括細胞數、細胞質量或細胞體積。

6.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（3）中，所述混合細胞樣品制成標品的方法包括：直接混勻冷凍或加入瓊脂糖混勻后進行冷凍，或者優選用瓊脂糖凝膠包裹形成均勻細胞團塊并進行福爾馬林固定，最終制成為福爾馬林固定的細胞蠟塊。

7.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（4）中，所述蛋白分析實驗包括蛋白質組樣本制備，方法如下：

a)標品前處理；

b)加入裂解液，超聲裂解；

c)去交聯，離心取上清；

d)蛋白濃度測定；

e)蛋白還原烷基化；

f)蛋白酶解；

g)肽段脫鹽抽干及復溶后肽段定量。

8.根據權利要求7所述的質控方法，其特征在于：

步驟a）中，標品前處理包括：冷凍樣本進行液氮研磨；細胞蠟塊標品先加入有機溶劑進行脫蠟，結束后采用不同比例乙醇進行脫蠟后的復水；

步驟b）中，加入裂解液，超聲裂解包括：裂解液含有SDS、尿素、EDTA或酶抑制劑中的一種或幾種，超聲裂解優選為使用超聲探頭接觸式超聲，1~5s-on，1~5s-off，時間3-20 min；

步驟c）中，去交聯，離心取上清包括：去交聯為溫度80~100 ℃，離心為2-4℃，8,000-12,000 g 5-60 min；

步驟d）中，蛋白濃度測定包括：使用BCA方法進行蛋白定量；

步驟e）中，蛋白還原烷基化包括：加入二硫蘇糖醇后于45～95℃條件下反應5～60分鐘，再加入烷基化試劑碘乙酰胺或氯乙酰胺避光室溫反應5~60分鐘；或直接加入三(2-羧乙基)膦及氯乙酰胺，45～95℃條件下反應5～60分鐘；

步驟f）中，蛋白酶解包括：使用SP3磁珠試劑盒對蛋白進行富集清洗，再加入酶解緩沖液，反應條件為溫度為25～37 ℃，時間為2～16小時；

步驟g）中，肽段脫鹽抽干包括：使用冷凍旋轉真空干燥進行抽干。

9.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（4）中，所述蛋白分析實驗包括蛋白質譜檢測，方法包括以下步驟：使用液相色譜-串聯質譜法進行檢測，檢測方法包括DIA、DDA、PRM檢測方法。

10.根據權利要求1所述的質控方法，其特征在于，步驟（5）中，對數據中特定蛋白定量數據進行定量對比包括：使用軟件包括Spectranaut、MaxQuant、PEAKs對原始數據進行定性定量比對分析抽提得到總蛋白定量表，對總蛋白定量表進行數據校正，校正方法包括中位數校正、FOT校正、iBAQ校正、內標校正，對反映細胞特征的蛋白進行分析比較，并計算相應細胞比例以檢測分析方法抗異質性及高豐度蛋白的干擾。