[發(fā)明專利]slr0681基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111242877.8
• 申請(qǐng)日: 2021-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN113817752B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳高;耿耘;鐘懷榮;孫秀芹;宣寧;張婧;崔曉艷;牛旭東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 濟(jì)南竹森知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明涉及slr0681基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用，本發(fā)明首次公開了集胞藻PCC6803的slr0681基因在高鹽環(huán)境下對(duì)類胡蘿卜素合成有顯著影響，本發(fā)明利用同源重組方法構(gòu)建了slr0681基因敲除突變株Δslr0681，結(jié)果表明高鹽脅迫條件下，Δslr0681生長狀況具有明顯優(yōu)勢(shì)，總類胡蘿卜素和葉綠素a含量增加，HPLC分析表明藍(lán)藻葉黃素、玉米黃素、海膽酮、β?胡蘿卜素含量與野生型相比分別增加1.2倍、1.1倍、1.7倍和1.05倍，PSI中psaA、psaB、psaL和PSII中psbB、psbD基因的表達(dá)都有所增加。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及slr0681基因在合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用，特別涉及集胞藻PCC6803中slr0681基因在高鹽脅迫條件下合成集胞藻類胡蘿卜素中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

藍(lán)藻(cyanobacteria)是地球上出現(xiàn)最早的光合自養(yǎng)原核生物，是最重要的原初生產(chǎn)者之一。藍(lán)藻細(xì)胞能進(jìn)行自養(yǎng)生長，可以不依賴外界的有機(jī)物生存，也能利用簡單的無機(jī)物合成有機(jī)物為生命活動(dòng)提供能量。并且多數(shù)藍(lán)藻及其提取物對(duì)人畜無毒，是轉(zhuǎn)基因研究的良好受體。集胞藻PCC6803(Synechocystis?sp.PCC?6803)是一種單細(xì)胞藍(lán)藻，有天然的外源DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有生長速度快、培養(yǎng)條件簡單、不產(chǎn)生毒素、遺傳背景清晰、表達(dá)外源產(chǎn)物不形成包含體等優(yōu)點(diǎn)，適合于利用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，是理想的藍(lán)藻基因工程受體。

類胡蘿卜素在動(dòng)物和人體中發(fā)揮著重要的作用，如預(yù)防疾病、提高機(jī)體免疫力、維持動(dòng)物正常生長與繁殖等方面。是一類脂溶性的類異戊二烯化合物，是進(jìn)行光合作用的生物產(chǎn)生的親脂性色素，在許多生物中起著核心作用，通過猝滅活性氧，以防止氧化，并且在光合生物中收集光能。

近年來，類胡蘿卜素在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品以及飼料行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，隨著人們健康意識(shí)的不斷加強(qiáng)，從天然原料中獲得的類胡蘿卜素受到越來越多的消費(fèi)者歡迎。目前，類胡蘿卜素的生產(chǎn)方式主要有化學(xué)合成、天然提取與生物合成三種。相對(duì)于前兩種方式，微生物合成的方式則安全、天然，是健康可行的生產(chǎn)類胡蘿卜素的方式。

藍(lán)藻中色素的積累受外界環(huán)境的影響，如光照、營養(yǎng)鹽、溫度以及酸度等。集胞藻是一種中等耐鹽量的淡水藍(lán)細(xì)菌，可在短時(shí)間內(nèi)耐受高達(dá)1.2mol/L的氯化鈉。在培養(yǎng)基中加入高鹽后，細(xì)胞內(nèi)自由水減少，且濃度增加的無機(jī)離子對(duì)細(xì)胞的新陳代謝產(chǎn)生毒性作用。藍(lán)藻細(xì)胞使用“鹽外排策略”來適應(yīng)高鹽環(huán)境。首先藍(lán)藻細(xì)胞會(huì)迅速失水和收縮。然后，Na⁺和Cl^-進(jìn)入細(xì)胞會(huì)降低水勢(shì)，水會(huì)回流到細(xì)胞中。細(xì)胞中高Na⁺含量會(huì)抑制細(xì)胞中的各種生理反應(yīng)，特別是光合作用和翻譯。將有毒的Na⁺交換為毒性較小的K⁺可以重新激活光合作用，并開始合成兼容的溶質(zhì)。藍(lán)藻的主要相容溶質(zhì)是葡萄糖基甘油，積累葡萄糖基甘油允許多余的離子流出，然后基因表達(dá)再次被激活，最后基因表達(dá)的變化導(dǎo)致完全適應(yīng)高鹽。

地球上的水資源是有限的，所以未來生物技術(shù)改造的藍(lán)藻的大規(guī)模培養(yǎng)必須依賴海水，因而理想的生產(chǎn)菌株須至少能在海水中生長，且最好能耐受更高濃度的鹽。

光系統(tǒng)I復(fù)合物(PSI)是光合膜上的色素蛋白復(fù)合物，能夠催化電子從質(zhì)體藍(lán)素(PC)經(jīng)一系列電子傳遞體到Fd(鐵氧化還原蛋白)。PSI由光能吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞所需要的一系列蛋白質(zhì)和結(jié)合在蛋白上的色素分子及電子傳遞鏈組成。藍(lán)藻中PSI反應(yīng)中心復(fù)合物基本包括PsaA-F和PsaI-L。在這些亞基中，PsaA-F主要參與電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，反應(yīng)中心核心亞基PsaA和PsaB在類囊體膜上以異二聚體狀態(tài)結(jié)合，PsaA或PsaB基因的缺失會(huì)導(dǎo)致PSI復(fù)合體在類囊體中缺失。PSI主要介導(dǎo)線性電子傳遞(LET)。同時(shí)，光合類囊體膜上還存在其他形式的電子傳遞途徑，包括圍繞PSI的循環(huán)電子傳遞(PSI-CET)，某些條件下，衣藻或某些原核藻類中還存在光合產(chǎn)氫途徑。這些交替電子傳遞途徑和線性電子傳遞協(xié)同運(yùn)作，保障了植物在逆境條件下高效的光合作用。目前在集胞藻PCC6803中slr0681基因和類胡蘿卜素合成之間的關(guān)系還未有報(bào)道。