[發明專利]人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基、配制方法及其應用

在審

• 申請號: 202111228764.2
• 申請日: 2021-10-21
• 公開（公告）號: CN113817671A
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 徐道俊;吳茂友;何志宇;李美玲
• 申請（專利權）人: 云南精準檢驗有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775;C12Q1/02
• 代理公司: 北京慧博知信知識產權代理事務所(普通合伙) 11458
• 代理人: 熊蘭蘭

1.一種人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，由：基礎培養基、誘導因子和添加因子組成；

其中基礎培養基為：青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM培養基；

誘導因子為：地塞米松、TGF-β1、維生素C磷酸鹽和ITS+1；

添加因子為：澤瀉醇B；澤瀉醇B的加入量大于50μmol/L。

其中所用基礎培養基、誘導因子可按經典成軟骨誘導分化完全培養基中各成分的比例添加配制。澤瀉醇B按經典成軟骨誘導分化完全培養基的配制要求選取上限值，例如200μmol/L。

2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，所述澤瀉醇B的加入量為50～200μmol/L。

3.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，所述澤瀉醇B的加入量為100μmol/L。

4.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，所述青霉素、鏈霉素、胎牛血清以及谷氨酰胺的用量分別為：

青霉素：100U/ml，鏈霉素：100ug/ml，FBS:總體積的5％，谷氨酰胺：2mM/L。

5.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，所述地塞米松、TGF-β1、維生素C磷酸鹽和ITS+1用量分別為：地塞米松：10μg/ml，TGF-β1：10ng/ml，維生素C磷酸鹽：50μg/ml，ITS+1：1％。

6.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基，其特征在于，所述ITS+1各組分用量為：

重組人胰島素：10mg/ml，人轉鐵蛋白：0.55mg/ml，亞硒酸鈉：0.5ug/ml，BSA：50mg/ml，亞油酸：470ug/ml，不含酚紅的EBSS：5ml。

7.一種如權利要求1～6中任一項所述的人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基配制方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在無菌環境下進行操作，向高糖DMEM培養基中分別加入5％比例的FBS、100U/ml的青霉素和100ug/ml鏈霉素和2mML谷氨酰胺，混合攪拌均勻；

2)隨后分別加入10μg/ml地塞米松、10ng/ml TGF-β1、50μg/ml維生素C磷酸鹽和1％ITS+1，混勻得到混合培養基；

3)在混合培養基中加入澤瀉醇B并混勻，得到人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化培養基。

8.一種人臍帶間充質干細胞體外誘導定向分化軟骨細胞的方法，包括以下步驟：

1)人臍帶間充質干細胞的體外分離及培養：

取來自18-26周歲、健康、首次妊娠、夫妻兩家均無遺傳病史以及大病史、剖腹產的孕婦的臍帶，無菌條件下分離臍帶華通氏膠，用無血清無酚紅間充質干細胞培養基培養擴增人臍帶間充質干細胞，待細胞長出并增值一定數量后用重組胰酶消化細胞，并進行多次傳代培養，直至傳代培養到P10代；

2)流式細胞技術鑒定細胞表面抗原：

取任意傳代培養的人臍帶間充質干細胞，對其進行表面抗體標記，通過流式細胞技術確定標記抗體所占的比列，以此對人臍帶間充質干細胞進行確認；

3)將所確認的人臍帶間充質干細胞接種于如權利要求1～6中任一項所述的培養基中并進行誘導培養后，得到軟骨細胞；

所述表面抗體標記位點為CD90、CD105、CD73、CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR。

9.一種按如權利要求8中所述方法誘導分化培養得到的軟骨細胞，其特征在于，所述軟骨細胞通過阿利新藍染色液染色后，在熒光倒置顯微鏡下觀察軟骨陷窩，結果發現，與普通培養基及其商業化培養基培養的成軟骨細胞相比較，所得軟骨細胞內的內酸性粘多糖被阿利新藍染成藍色，軟骨陷窩間分散平滑。