[發明專利]一種將目的基因定點整合至免疫細胞特定位點的方法及其應用

在審

• 申請號: 202111208589.0
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN115992175A
• 公開（公告）日: 2023-04-21
• 發明（設計）人: 請求不公布姓名;李賽;張麗琴
• 申請（專利權）人: 西安宇繁生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C12N15/113;C12N15/62;C12N9/22;C12N15/867;A61K35/17;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02;A61P9/00;A61P31/00;A61P37/02
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 王立紅;張丹

1.一種將目的基因定點整合至免疫細胞特定位點的方法，其包括如下步驟：

S1，構建同源重組修復模板載體；

S2，將基因編輯系統、步驟S1所得載體共同引入免疫細胞中；

任選地，S3，將步驟S2所得免疫細胞進行培養和鑒定。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定位點為HPK1、PD-1、TRAC；優選地，所述特定位點為HPK1，特別是HPK1?EXON。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中所述載體選自：腺相關病毒、微環DNA、雙鏈DNA或單鏈DNA；

優選地，所述載體為微環DNA。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中所述同源重組修復模板從5’到3’依次包含：靶序列(TSF)、左端同源臂(LHA)、啟動子、目的基因、polyA、右端同源臂(RHA)、靶序列(TSF)。

5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述目的基因為CAR基因；

優選地，所述CAR識別的靶標選自：RORl、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、葉酸受體抗體、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD276、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎兒型乙酰膽堿受體、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ輕鏈、Lewis?Y、L1細胞粘附分子(CD171)、MAGE-A1、間皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配體、NY-ESO-1、MART-1、gp100、瘤胎抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異抗原、PSMA、雌激素受體、孕激素受體、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGEA3、CE7、Wilms腫瘤1(WT-1)、細胞周期蛋白A1(CCNA1)、BCMA和白介素12或其組合；

更優選地，所述CAR基因包含如SEQ?ID?NO:17所示的核苷酸序列。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，TSF包含如SEQ?ID?NO：16所示的核苷酸序列。

7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述左端同源臂和右端同源臂的長度分別為200-1000bp；

優選地，所述左端同源臂和右端同源臂分別包含如SEQ?ID?NO：9和10所示的核苷酸序列，或分別如SEQ?ID?NO：9和10所示；或，

所述左端同源臂和右端同源臂分別包含如SEQ?ID?NO：11和12所示的核苷酸序列，或分別如SEQ?ID?NO：11和12所示；或，

所述左端同源臂和右端同源臂分別包含如SEQ?ID?NO：13和14所示的核苷酸序列，或分別如SEQ?ID?NO：13和14所示。

8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述啟動子為EF1αpromoter。

9.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述polyA為BGHpA、SV40?polyA或WPRE；優選地，所述polyA為SV40?polyA。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因編輯系統選自：CRISPR、ZFN、TALEN；優選地，所述基因編輯系統為CRISPR系統。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述CRISPR系統的核酸酶選自：SpCas9、SaCas9、eSpCas9、Cas12a、Cas13和cpf1；優選地，所述的核酸酶為SpCas9。